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1目的(1)基于ITS序列分析,开发霍山石斛特异性PCR引物,用于鉴别霍山石斛、铁皮石斛和河南石斛。(2)开发霍山石斛微卫星位点,丰富霍山石斛微卫星文库内容,以期开发出一对用于鉴别霍山石斛和铜皮石斛的特异性微卫星引物,同时为后期研究霍山石斛遗传结构及其多样性提供基础。(3)基于重测序开发霍山石斛和铜皮石斛之间的SNP位点,用于鉴别霍山石斛和铜皮石斛。2方法(1)通过测序得到四种石斛的ITS序列,联合GenBank下载的序列,在BioEdit分析软件进行比对分析,利用primer5及olige6软件针对霍山石斛及其伪品铁皮石斛和河南石斛之间序列的差异位点,设计特异性引物。PCR反应,电泳检测,以筛选霍山石斛呈阳性反应(有亮带),而铁皮石斛和河南石斛呈阴性反应(无亮带)的引物为目标引物。并进行样本验证。(2)基于微卫星位点(SSR)多态性高的特点,分别以(CT)12、(GAA)8为杂交探针,采用磁珠富集法开发霍山石斛的微卫星位点,并在开发所得的微卫星位点片段两端设计正反向引物,对霍山石斛和铜皮石斛进行PCR反应,筛选能明显区分霍山石斛和铜皮石斛的引物。(3)以铁皮石斛基因组序列为参考基因,对霍山石斛和铜皮石斛重测序,开发SNP位点,鉴别霍山石斛和铜皮石斛。3结果(1)基于ITS序列上碱基变异位点,在所设计的引物中,引物SH-CP9s/SH-CP9a在PCR之后,电泳检测显示,在2%的琼脂糖凝胶上,退火温度为58℃时,霍山石斛的DNA样品有亮带,而铁皮石斛和河南石斛的DNA样品无亮带。此外,在样本验证的过程中,也出现同样的结果。(2)通过磁珠富集法,共收集微卫星位点200个,剔除无法在两端设计引物或设计所得的引物评分较低的位点片段,共设计得到100对SSR引物。但在对霍山石斛和铜皮石斛的鉴别引物筛选中,并没得到能够明显区分霍山石斛和铜皮石斛的SSR引物。(3)在铁皮石斛基因组范围内共获得了8,342,377个SNPs,其中有0(0.00%)个位于编码区域,霍山石斛与铁皮石斛之间的SNP位点共有3,201,895个,铜皮石斛与铁皮石斛之间得SNP位点共有3,155,447个,而霍山石斛样品组内SNP位点共有987,414,铜皮石斛样品组内SNP位点有997,621个。4结论(1)基于ITS序列所设计的特异性鉴别引物SH-CP9s/SH-CP9a能够有效的区别霍山石斛及伪品铁皮石斛和河南石斛,且该结果的稳定性在后期的样本验证中也得到了证实。(2)基于当前所开发的微卫星位点,在琼脂糖电泳的前提下,无法区分出霍山石斛和铜皮石斛。而通过磁珠富集法得到的SSR位点引物可用于后期霍山石斛道地性的分子标记研究及种群遗传和生物保护的研究。(3)在铁皮石斛基因组范围内共获得了8,342,377个SNPs。因此,在后续的分析实验中,对霍山石斛和铜皮石斛的SNP位点进行比对,筛选出霍山石斛与铜皮石斛之间的SNP位点,并可更依据这些位点设计引物,对霍山石斛和铜皮石斛进行鉴别。