表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)是由53个氨基酸组成的多肽。因其具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景,对EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。　　 本研究目的在于构建一种新型的能够在藻细胞分泌表达外源基因的分泌型表达载体,并实现表皮生长因子的分泌型表达。本实验主要采用集胞藻6803(Synechocytis sp.PCC6803)的某些分泌性蛋白的分泌信号肽序列片段插入pET-His载体多克隆位点上游作为分泌信号肽,实现人表皮生长因子在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的分泌型表达,同时得到一种可以用于在藻类分泌型表达hEGF的新型表达载体。　　 首先,优化设计目的人表皮生长因子的基因序列。依照螺旋藻密码子的偏嗜性设计了hegf基因序列合成了密码子优化的hegf基因,并将其插入表达载体pET-His中构建了pET-His-EGF质粒,在表达菌株E.coli BL21(DE3)plysS中表达目的蛋白,SDS-PAGE检测结果表明表达菌株中主要以包涵体形式存在,表达量约为14％。转化菌株培养后进行超声破碎,沉淀经过包涵体洗涤液洗涤后,通过割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫得到兔抗hEGF多克隆抗体,抗体效价约为1:50000。纯化后的多克隆抗体用于后续实验中分泌型表达的检测。　　 其次,构建分泌型表达载体。通过Cyanobase藻类学数据库的查询,从集胞藻6803转译后加工过程中的某些蛋白的分泌信号序列得到可以用于分泌型表达的信号序列,进一步通过SignalP3.0 Server分析软件预验证,从集胞藻6803得到可行性序列分别命名为A(sll0172)、B(slr2101)、C(sll1483)、D(sll0427),它们分别是不同蛋白的信号序列,将这些信号序列插入pET-His-EGF表达载体hegf基因上游,得到了带有分泌型信号的pS-X系列表达载体。其中hEGF在pS-A载体中实现分泌型表达,在其它三个载体中未见表达。A序列为一种周质蛋白的信号序列,结构分类为膜蛋白。　　 本研究主要对pS-A表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的各部分:从培养基,周质,胞质和沉淀部分,分别通过SDS-PAGE,Western印迹分析验证了hEGF的表达结果,其中目的蛋白有分泌到细胞外,但是主要分泌到细胞周质中,我们通过两种方法处理使周质蛋白释放到目的液中,验证分析后得到,分泌到周质空间的相对表达量约为1％,在细胞质和沉淀中也有hEGF的表达。该新型分泌型表达载体是利用蓝藻信号序列作为分泌表达的信号肽,能在大肠杆菌中分泌表达,说明是一种广谱的原核型分泌表达载体,为人表皮生长因子在螺旋藻中表达奠定基础。　　 此外,本研究将hEGF插入大肠杆菌的分泌型表达载体plpp-OmpA构建了plpp-OmpA-EGF表达载体,将该表达载体在E.coli BL21(DE3)plysS和TOPlOF中诱导表达,均未见目的蛋白表达。说明我们的表达载体pS-A在原核生物分泌表达hEGF时具有一定的优越性。　　 本研究的特色在于将蓝藻的中的分泌型蛋白的分泌信号片段作为信号肽导入E.coli载体中进行人表皮生长因子的分泌型表达,为蛋白在包括蓝藻在内的原核生物中进行分泌型表达建立了良好的载体模式,具有广泛的应用前景。