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【研究背景】增生性瘢痕是人类皮肤真皮受损后，局部以大量胶原沉积为特征的皮肤纤维化疾病。大量研究表明，作为瘢痕中的最主要细胞成纤维细胞，其活化、增殖、合成分泌胶原以及分化异常，是增生性瘢痕发生及发展的重要原因之一。结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF，又称为CCN2）作为转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的共作用因子在调控成纤维细胞功能方面发挥重要作用，被认为是一种强烈的致纤维化因子。整合素ανβ3是CCN2的主要受体之一，研究表明其在传递和细胞增殖、分化、运动、分布、定居、生存或凋亡等有关的细胞信号方面发挥重要作用；MAPK信号通路是真核细胞调控介导细胞内信号转导的重要系统，它可以被外界各种刺激所激活，而且已有报道提示它可能参与了CCN2调控纤维化发生的过程，但其作用在各个脏器中的报道并不一致，存在组织器官特异性，其具体的分子机制尚不清楚。因此本课题主要对CCN2在增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用及相关机制进行系统性研究，通过观察其受体整合素ανβ3及下游MAPK信号通路在其中发挥的作用，明确CCN2在增生性瘢痕形成及发展中的具体作用机制，希望能为阐明增生性瘢痕的发病机理提供新思路。【研究目的】1.明确CCN2的受体整合素ανβ3在增生性瘢痕组织、瘢痕成纤维细胞中的表达调控机制。2.明确MAPK信号通路在CCN2调控增生性瘢痕中的具体作用，初步探讨其作用机制，并在兔耳瘢痕模型中进行验证。【研究内容】1.检测CCN2的受体整合素ανβ3在增生性瘢痕组织、瘢痕成纤维细胞中的表达情况。2.检测在CCN2诱导增生性瘢痕成纤维细胞转分化过程中，其相应标志性分子的表达变化情况，整合素αν、整合素β3受体分子的表达变化；应用整合素ανβ3的特异性阻断剂LM609，观察其在增生性瘢痕成纤维细胞转分化过程中作用，并用三维凝胶收缩实验检测增生性瘢痕成纤维细胞收缩功能的改变。3.使用CCN2刺激增生性瘢痕成纤维细胞后，采用免疫印迹的方法，观察MAPK信号通路的激活情况；通过应用该信号通路的特异性阻断剂，检测增生性瘢痕成纤维细胞转分化标志分子表达特性的变化；用CCN2或与TGF-β1联合刺激正常真皮成纤维细胞，观察其α-SMA、胶原Ⅰ及胶原Ⅲ表达的变化；采用免疫印迹、免疫组织化学的方法，观察磷酸化ERK及JNK在增生性瘢痕中的表达情况；构建兔耳增生性瘢痕模型，观察CCN2与MAPK阻断剂的作用。【研究结果】1.通过检测发现，增生性瘢痕组织中整合素αv、整合素β3受体的表达水平显著上调；而且，在增生性瘢痕成纤维细胞中，整合素αv、整合素β3受体的表达水平也显著上调。2. CCN2作用增生性瘢痕成纤维细胞后，α-SMA、胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达均明显升高，整合素αv、整合素β3受体的表达水平也显著上调；应用整合素ανβ3的特异性阻断剂LM609，可以明显抑制CCN2诱导增生性瘢痕成纤维细胞后α-SMA、胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达；三维凝胶收缩实验显示，LM609可以显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞的收缩功能。3.使用CCN2刺激增生性瘢痕成纤维细胞后，可诱导细胞中ERK1/2、p38、JNK信号通路的磷酸化，其中ERK1/2、JNK信号通路的磷酸化至15min时达到高峰，p38信号通路的磷酸化至30min达到高峰，通过应用其特异性阻断剂PD98059、SB203580、SP600125，可以显著抑制CCN2所诱导MAPK信号通路的磷酸化。4.应用PD98059后，可明显抑制CCN2所导致的胶原ⅠmRNA的表达。然而，应用SB203580和SP600125后，对CCN2所导致的胶原ⅠmRNA的表达未见明显抑制作用；Western-blot结果显示，在应用这3个阻断剂后，CCN2所诱导的Ⅰ型胶原表达被抑制，并且PD98059的抑制效果最强。在对增生性瘢痕成纤维细胞分泌胶原的水平进行检测时发现， PD98059和SP600125可明显降低CCN2所导致的Ⅰ型胶原分泌，而SB203580对CCN2所导致的Ⅰ型胶原分泌未见明显的抑制作用。5. Western-blot结果显示，CCN2作用增生性瘢痕成纤维细胞后48h，α-SMA的表达明显升高，在应用SB203580，SP600125或PD98059预处理后，α-SMA表达的升高可被明显抑制，且PD98059组的作用最为明显。细胞免疫荧光结果显示，CCN2作用48h后，增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA的表达明显升高，而SP600125或PD98059预处理后，α-SMA的表达显著下调，且PD98059组的作用最为明显，但应用SB203580预处理后，α-SMA的表达升高未被明显抑制。6.应用TGF-β1+CCN2联合处理后，可以使正常成纤维细胞中α-SMA、胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达明显升高，CCN2单独处理时未见明显变化，而且在应用TGF-β1Ⅰ型受体的特异性阻断剂SB431542预处理后，可显著降低TGF-β1与CCN2联合作用所导致α-SMA、胶原Ⅰ及胶原Ⅲ表达的升高，而且Western-blot的结果显示，单独应用SB431542预处理后，与对照组相比可以抑制正常成纤维细胞中胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达。7.采用Western-blot及免疫组织化学的方法，我们发现与正常皮肤组织相比，增生性瘢痕组织中磷酸化ERK和JNK的表达均明显升高。8.在体内试验中，我们成功构建兔耳增生性瘢痕模型，发现与对照组相比，SP600125或PD98059处理组，兔耳瘢痕质地较柔软平整，可明显抑制兔耳瘢痕的增生，而且单独应用CCN2并不能加重瘢痕的增生程度；胶原染色发现，对照组、PBS处理组、CCN2处理组胶原纤维致密粗大，真皮层较厚，胶原纤维排列紊乱；CCN2+SP600125组、CCN2+PD98059组、PD98059组及SP600125组，真皮层亦增厚，但较对照组、PBS组、CCN2组薄，胶原纤维排列较整齐，胶原纤维较稀疏。【研究结论】1.与自体正常皮肤及正常真皮成纤维细胞相比，增生性瘢痕组织及增生性瘢痕成纤维细胞中整合素αv、整合素β3受体的表达水平均显著上调。2. CCN2作用增生性瘢痕成纤维细胞后，可以诱导其发生转分化，并且在这个过程中CCN2的受体整合素ανβ3发挥重要作用。3. CCN2可以明显激活MAPK信号通路，外源性的抑制ERK1/2、JNK信号通路，可显著抑制CCN2所诱导的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达。4.在体内试验中，我们成功构建兔耳增生性瘢痕模型，通过外源性的抑制ERK1/2、JNK信号，可以明显抑制瘢痕增生。