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研究背景激活素A属于TGF-β超家族成员,其受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶(Ser/Thr)型受体,分为I型受体及II型受体,激活素与II型结合,再招募I型受体,进而通过细胞内Smads信号蛋白,或非Smads依赖的MAPK通路、Rho GTPase通路和PI3K/Akt通路传导信号至细胞核,激活靶基因转录。有关研究显示,激活素A的表达与肿瘤的发生发展密切相关,参与多种肿瘤细胞增殖及凋亡调控。如大肠癌及骨肉瘤等患者外周血激活素A水平升高,大肠癌及卵巢癌等组织高表达激活素A,激活素A可以诱导肺腺癌细胞凋亡、促进前列腺癌细胞转移,激活素A表达异常还与肿瘤恶液质形成有关等。DNA甲基化是由DNA甲基化转移酶DNMTs(DNA methyltransferases,Dnmts)催化并维持的,DNMTs家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b及DNMT3L。DNMTs是调控表观遗传学DNA甲基化的重要分子,DNMT1主要起维持性甲基化酶作用。以往的研究显示,DNMTs在肿瘤细胞中高表达,DNMTs的表达还能影响胚胎发育过程,推测细胞核潜能越高与DNMTs的调控关系越密切。激活素也具有调控中胚层细胞发育及肿瘤细胞增殖的作用,但是,激活素A能否通过调控DNMTs表达,影响肿瘤细胞增殖及凋亡,仍不清楚。因此,本研究通过预实验,选择对激活素A敏感的小鼠骨髓瘤细胞系NS-1细胞作为靶细胞,探讨激活素A调控NS-1细胞增殖及凋亡与DNMT1表达的关系。课题分为四方面进行论述,第一部分分析了激活素A对多种肿瘤细胞的生物学作用,探讨激活素A作用与DNMT1关系。第二部分阐述了激活素A调控小鼠骨髓瘤细胞NS-1增殖及凋亡作用及其信号机制,分析激活素信号蛋白Smad3 Knock-down及过表达对DNMT1的影响。第三部分通过DNMT1Knock-down,进一步探讨改变DNMT1表达对激活素A抑制NS-1细胞增殖及诱导凋亡的影响及其机制。第四部分建立NS-1荷瘤鼠模型,评价激活素A及DNMT1 Knock-down对小鼠体内NS-1细胞成瘤的影响。研究方法RT-PCR及Western blotting检测DNMT1在NS-1细胞的表达。MTT法、CFSE染色、Hochest33342染色及Annexin V-7AAD评价NS-1肿瘤细胞活力及凋亡。构建pLVX-U6/Puro-DNMT1 sh RNA表达质粒,转染NS-1细胞评价敲低DNMT1基因对细胞增殖及凋亡的影响。建立NS-1细胞荷瘤鼠模型,HE染色、免疫组织化学染色、Tunel法评价DNMT1基因Knock-down对NS-1细胞成瘤的影响。研究结果第一部分激活素A对多种肿瘤细胞活性及DNMT1表达的影响DNMT1在肿瘤细胞高表达,而在正常组织来源细胞低表达。Giemsa染色法显示激活素A作用于SW480、Hela、A549、NS-1细胞后发生明显的细胞形态学改变,提示激活素A可以影响NS-1细胞形态变化。且在低浓度5ng/ml时激活素A即可影响NS-1细胞形态变化。同时可见激活素A可以显著抑制骨髓瘤细胞系NS-1细胞DNMT1表达。因此,实验采用NS-1细胞作为激活素A敏感细胞,进行后续研究。第二部分激活素A诱导小鼠骨髓瘤细胞系NS-1凋亡为了确定激活素A对NS-1细胞的作用,实验首先采用MTT法检测NS-1细胞活力,结果显示激活素A可以抑制NS-1细胞活力。CFSE染色进一步显示,激活素A抑制了NS-1细胞增殖。Hocheast染色和Annexin V-7AAD结果显示激活素A可以促进NS-1细胞凋亡。Western blotting结果显示激活素A上调NS-1细胞Bax、Cyc C及Caspase3表达,而抑制Bcl2及DNMT1表达,提示激活素A通过线粒体凋亡途径诱导NS-1细胞凋亡,其作用可能与下调DNMT1表达有关。进一步研究显示,激活素A可以促进NS-1细胞表达激活素信号蛋白Smad3,但过表达和Knock-down Smad3不能影响NS-1细胞DNMT1表达,提示激活素A可能通过Smad3信号非依赖途径调控DNMT1表达。第三部分DNMT1 Knock-down对NS-1细胞的活力及凋亡的影响Western blotting结果显示构建的pLVX-DNMT1干涉质粒转染NS-1细胞成功敲低了DNMT1表达,同时上调NS-1细胞Cyc C及Caspase3表达及Bax/Bcl2比值。MTT结果显示NS-1细胞转染0.5μg pLVX-DNMT1质粒24h后,与pLVX对照组质粒转染NS-1细胞组比较细胞活力明显下降;添加5ng/ml激活素A组,较激活素A处理的pLVX对照组质粒转染NS-1细胞组细胞活力进一步下降。Annexin V-7AAD结果显示转染pLVX-DNMT1质粒可以诱导NS-1细胞发生凋亡。第四部分DNMT1 Knock-down对小鼠NS-1细胞成瘤的影响为了进一步确定DNMT1 Knock-down对激活素A诱导NS-1细胞凋亡的影响,实验首先采用不同浓度的NS-1细胞接种Balb/c小鼠背部,观察成瘤情况。结果显示2.0x106 NS-1细胞/0.1ml接种小鼠背部皮下,成功构建了NS-1细胞荷瘤鼠模型。进一步分析DNMT1 Knock-down对小鼠NS-1细胞体内成瘤影响。实验采用预转染pLVX-NC空质粒、转染pLVX-DNMT1 sh RNA表达质粒及未转染质粒的野生型NS-1接种Balb/c小鼠背部,体内测量肿瘤体积结果显示,与pLVX-NC组相比,pLVX-DNMT1组的NS-1细胞成瘤能力明显减弱,且体积增长减慢。提示DNMT1 Knock-down可以抑制NS-1细胞体内成瘤能力。待肿瘤生长到第18天处死Balb/c小鼠取肿瘤,结果显示与pLVX-NC组相比,pLVX-DNMT1组的NS-1细胞肿瘤体积明显降低,具有统计学差异。提取肿瘤组织总蛋白Westernblotting结果显示pLVX-DNMT1组成功敲底了DNMT1的表达,且HE染色结果和免疫组织化学染色结果显示与pLVX-NC组相比,pLVX-DNMT1组细胞核浆比例明显增加、排列紊乱、局部出现脓肿和坏死,提示DNMT1 Knock-down可以诱导NS-1细胞瘤发生凋亡,可能具有骨髓瘤治疗价值。Tunnel染色显示与激活素A处理的pLVX-NC组相比,激活素A处理的DNMT1 Knock-down的NS-1细胞肿瘤组织存在更多的染色阳性细胞,提示DNMT1 Knock-down促进了激活素A诱导NS-1细胞凋亡作用。综上所述,DNMT1是DNA甲基化表观遗传学调控的重要分子蛋白,降低NS-1细胞DNMT1的表达水平,可以通过线粒体凋亡途径抑制NS-1细胞增殖、促进NS-1细胞凋亡。激活素A可以调控肿瘤细胞DNMT1表达,对治疗DNA甲基化修饰异常所引发的肿瘤疾病具有重要的意义。