根据前期的中药材成分数据统计,筛选获得山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸。采用网络药理学分析山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸对肺癌的作用机制,根据预测分析结果设计试验,探讨三种单体对H446细小细胞肺癌细胞和H1299非细小细胞肺癌细胞的信号通路与作用机制。为山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸在肺癌预防及治疗的试验研究提供理论依据。从TCMSP、Swiss Target Prediction和SEA数据库检索出三种单体的靶点,从Genecards数据库中检索肺癌疾病的靶点,Cytoscape制作单体-靶点网络。交集靶点在STRING平台进行PPI分析。采用Metascape对交集靶点进行GO分析。Clu GO分析信号通路,同时核心靶点在KEGG数据库检索信号通路并标注位于核心信号通路位置。最后Dockthor平台进行分子对接,Pymol对接结果可视化。根据网络药理学对三种单体的分析结果设计实验。首先进行CCK-8实验检测三种单体对H446和H1299细胞的毒性作用,计算半抑制浓度,以半抑制浓度为加药量进行后续试验。细胞划痕实验研究三种单体对细胞迁移的影响,HE染色判断三种单体对细胞生长的影响,Hochest/PI实验观察单体对肺癌细胞凋亡的作用。根据细胞生长状态,免疫荧光检测单体对细胞增殖相关蛋白表达的影响。最后Western Blot实验检测单体对H446细胞雌激素信号通路中相关蛋白表达的影响。根据网络药理学的信号通路分析,山奈酚与肺癌的交集靶点54个,对香豆酸与肺癌的交集靶点30个,原儿茶酸与肺癌的交集靶点76个。山奈酚、对香豆酸作用于肺癌细胞的首要靶点为ESR1,而原儿茶酸作用于肺癌细胞的首要靶点为RARB。Clu GO结果显示,三种单体在雌激素信号通路和非小细胞肺癌的发展具有重要的影响。京都基因与基因组百科全书KEGG结果显示,16个核心靶点中有13个靶点位于癌症信号通路。涉及的靶点为JUN、ESR1、RXRB、RXRG、RXRA、RARA。ESR1与ESR1复合体可间接或直接的上调细胞周期中Cyclin D1蛋白的表达,而RARB则可以抑制雌激素信号通路的激活。分子对接结果显示,山奈酚与RARB对接时在GLU-165形成两个氢键,原儿茶酸与ESR1和RARB连接时,分别在GLU-71和GLU-180形成两个氢键。根据HE染色结果,对香豆酸组与DMSO对细胞的影响较小,细饱满,生长状况良好。山奈酚组细胞情况与原儿茶酸组类似,出现细胞死亡,大部分细胞呈现纤维状,部分细胞呈现皱缩态势。划痕实验显示,在IC50浓度下,山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸的划痕面积减少的比例相对CK对照组有明显的减少,在单体处理后的细胞相对于CK对照组存在着降低细胞迁移能力。三种单体作用H446细胞后凋亡实验和免疫荧光实验显示,三种单体均促进了细胞的凋亡,对香豆酸和原儿茶酸抑制了细胞的增殖。Western Blot结果显示,山奈酚作用H446细胞后,上调SP1的表达,下调ESR1的表达,总体调控使得下游的CCND1蛋白表达无太大变化,Bcl-2表达下调,对香豆酸作用H446细胞后其蛋白的表达略有差异,可能是其他通路调控的增殖相关蛋白表达造成。原儿茶酸则相对上调了SP1表达和下调了ESR1的表达,总体调控使得下游的CND1表达上调控,Bcl-2的表达下调。结果与免疫英荧光和凋亡结果呼应。山奈酚下调SP1的表达和上调了CCND1的表达,山奈酚和对ESR1的调控则出现了低浓度和高浓度均下调而中等浓度上调的差异情况,对香豆酸下调了ESR1、CCND1和Bcl-2的表达,即对香豆酸抑制了H1299细胞的增殖和促进其凋亡。原儿茶酸上调了SP1的表达,下调Bcl-2的表达。研究结果表明山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸通过雌激素信号通路影响细胞的增殖和凋亡;ESR1、SP1和辅酶形成结合体,共同调控下游CCND1基因的靶点。在体外研究表明对香豆酸和原儿茶酸抑制细胞的增殖;山奈酚、对香豆酸和原儿茶酸促进肺癌细胞的凋亡。ESR1和SP1蛋白的表达与CCND1和Bcl-2表达趋势不一致。进一步结合网络药理学的信号通路分析结果,三种单体的部分核心靶还位于钙信号通路、MAPKA信号通路和PIK/AKT信号通路中,这三种信号通路有可能调控着肺癌细胞的增殖和凋亡。