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登革热是登革病毒引起的、世界上最重要的虫媒传染病之一，根据临床症状分为普通登革热与重症登革热。近30年，登革热疫情迅速扩大，重症病例显著增加，虽然重症登革热的发病机制尚未完全阐明，但病毒毒力被普遍认为是重要的致病因素之一。广东省位于亚热带，气候潮湿，伊蚊密度高，是我国登革热的高发地区，发生过登革4种血清型病毒的流行。近年来，登革热疫情在该地区呈快速上升趋势。由于对广东地区登革病毒流行株的致病性知之甚少，严重阻碍了我国登革热疫情的有效预防与控制。因此，深入了解广东地区登革病毒流行株的致病性，并通过毒力位点分析，从基因水平初步阐述该地区登革病毒的毒力变化规律，对于指导我国登革热疫情的科学防控具有重要意义，也为登革病毒的毒力研究提供依据。 一、目的： 研究广东地区登革2型及4型病毒的致病性，分析可能导致毒力差异的关键位点，初步阐明广东地区近年来登革2型及4型病毒分离株在关键毒力位点上的差异，为我国登革热疫情的科学防控提供理论依据。 二、方法： 1、DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30的致病性研究： 1）研究对象：对广东2010年登革2型病毒流行株-广州40株（DENV-2-GZ40）及广东2010年登革4型病毒流行株-广州30株（DENV-4-GZ30）的致病性进行研究，并分别与1987年登革2型病毒广西43株（DENV-2-GX43）及1990年登革4型病毒广州 B5株（DENV-4-GZB5）对比分析。 2） DENV-2-GZ40、 DENV-4-GZ30对 C6/36细胞的致病性：分别将DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接种 C6/36细胞，初步观察细胞病变，并绘制病毒在 C6/36细胞上的生长曲线； 3）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30对 BHK-21细胞的致病性：分别将DENV-2-GZ40、DENV-2-GX43、DENV-4-GZ30、DENV-4-GZB5接种 BHK-21细胞，初步观察细胞病变，进一步采用噬斑实验观察病毒在 BHK-21细胞上的噬斑大小及形态，绘制病毒在 BHK-21细胞上的生长曲线。为了明确 DENV-2-GZ40对 BHK-21细胞的感染性，采用实时定量 RT-PCR方法测定感染细胞上清液中病毒量及间接免疫荧光实验检测感染细胞内的病毒抗原； 4）DENV-2-GZ40、DENV-4-GZ30对乳鼠的神经毒力：采用脑内注射途径感染昆明乳鼠，观察乳鼠发病、死亡情况，计算其对乳鼠的 LD50。 2、毒力位点分析： 1）分别比对 DENV-2-GZ40与 DENV-2-GX43、 DENV-4-GZ30与DENV-4-GZB5全基因序列，分析可能导致毒力差异的位点； 2）在 GenBank上搜索广东地区近年来登革2型、4型分离株的全基因序列，比对其在关键毒力位点的差异，推测差异可能导致的毒力变化。 三、结果： 1、登革2型病毒 GZ40的致病性： 在 C6/36细胞上，DENV-2-GZ40与 DENV-2-GX43均于接种3天后出现典型细胞病变，但 DENV-2-GZ40复制滴度稍低于 DENV-2-GX43。在 BHK-21细胞上，两毒株也于接种3天后出现细胞病变，DENV-2-GX43能形成清晰噬斑，直径0.44mm，DENV-2-GZ40不能形成噬斑；虽然感染 DENV-2-GZ40的 BHK-21细胞上清液及细胞内均可检测出病毒且病毒量随着感染时间延长而增加，但DENV-2-GZ40在 BHK-21细胞的复制水平明显低于 DENV-2-GX43。脑内注射DENV-2-GZ40病毒组乳鼠发病时间较脑内注射 DENV-2-GX43病毒组延迟，发病率低，其 LD50为606PFU，DENV-2-GX43对乳鼠 LD50为0.67PFU。 2、登革2型病毒的基因组差异及毒力位点分析： DENV-2-GZ40与 DENV-2-GX43在5’UTR有5个核苷酸差异，3’UTR有16个核苷酸差异，编码区有80个氨基酸差异，其中37个位点发生了电荷或疏水性的改变。毒力位点 E52、E71、E126及可能的毒力位点5’UTR-78、NS2A-139、NS4B-108、E116、E149、E184差异可能是导致 DENV-2-GZ40毒力减弱的原因。2001-2013年广东地区在 GenBank上有7株登革2型病毒全基因序列，在 E193、E203、NS1-164毒力位点有差异。 3、登革4型病毒 GZ30的致病性： 在 C6/36细胞上，DENV-4-GZB5于接种7天后出现细胞病变，DENV-4-GZ30接种细胞后未观察到典型病变，两毒株在 C6/36细胞上的复制水平相似。在BHK-21细胞上，两毒株均于接种2天后出现相似细胞病变，均能在 BHK-21细胞上形成噬斑，DENV-4-GZ30噬斑清晰，平均直径为0.35mm，DENV-4-GZB5噬斑弥散，平均直径为0.48mm，两者在 BHK-21细胞上复制水平相似。脑内注射 DENV-4-GZ30病毒组乳鼠发病时间较脑内注射 DENV-4-GZB5病毒组延迟，发病率低，其 LD50为297PFU，DENV-4-GZB5对乳鼠 LD50为0.35PFU。 4、登革4型病毒的基因组差异及毒力位点分析： DENV-4-GZ30与 DENV-4-GZB5在5’UTR有4个核苷酸差异，3’UTR有13个核苷酸不同及 DENV-4-GZ30有一段长13nt（10289-10302）的缺失，编码区有94个氨基酸差异，其中37个发生了电荷或疏水性改变。毒力位点 E120、NS5-201及 E46、E147、E221、E265差异可能与 DENV-4-GZ30减毒相关。1978-2013年广东地区在 GenBank上有6株登革4型病毒全基因序列，在 prM127、E155、NS5-201及 NS5-879毒力位点有差异。 四、结论： 1、DENV-2-GZ40株对 C6/36、BHK-21细胞系及乳鼠致病力弱，与其基因组部分位点变异有关；2001-2013年广东地区登革2型病毒在 E203、NS1-164毒力位点上的差异可能导致毒力变化。 2、DENV-4-GZ30株对 C6/36、BHK-21细胞系及乳鼠致病力弱，与其基因组部分位点变异有关；广东地区登革4型病毒在 E155、NS5-201毒力位点差异可能导致毒力变化。