热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是广泛存在于酵母菌至哺乳动物细胞内的一类高度保守的蛋白质,在生理条件或应激条件下,能在有机体组织细胞内大量、稳定表达,对维持细胞生存和内环境稳定起重要的作用,其中HSP70蛋白是HSPs家族中表达最广泛的蛋白,由于它具有促进蛋白质的合成、折叠、运输和清除变性蛋白,目前成为研究最为广泛的IISPs。本文主要通过建立体内外大鼠心肌细胞热应激模型,观察热应激过程中心肌细胞内HSP70及其相应hsp70 mRNA的表达与转录,研究HSP70变化规律与热应激心肌细胞损伤之间的相关性,以及在热应激过程中抗应激性损伤的保护作用与机制；通过RNA干扰技术在H9c2心肌细胞抑制Hsc70蛋白表达,探讨Hsc70在心肌细胞凋亡中的作用。将60只220±20 g的SD大鼠随机分成6组,每组10只,将所有试验大鼠均进行为期20天的适应性饲养,使试验大鼠适应新的饲养环境,以减少外界环境应激因素的影响。适应性饲养结束后,将试验组大鼠的环境温度于30 min内由22±1℃迅速提高到42土1℃进行热应激处理,而对照组大鼠仍然置于正常饲养环境(22±1℃)中。热应激20 min、40 min、60 min、80 min和 100 min后,用眼球取血法,分离血清,检测血清中CK、CK-MB和LDH的含量。采血后迅速剖杀对照组和热应激试验组,将大鼠心脏其中一部分固定于10%中性福尔马林中,24h后换新鲜固定液,用于组织病理学、免疫组织化学检测；剩余部分细胞则速冻于液氮中,然后-70℃保存,提取蛋白和RNA分别用于Western Blot和荧光定量RT-PCR研究。将H9c2心肌细胞在37℃二氧化碳细胞培养箱中培养48 h细胞融合度达到90%以上后,迅速将H9c2心肌细胞置于预热的42℃二氧化碳培养箱中,热应激处理20 min、 40 min、60 min、80 min和100 min后收取样品。热应激结束后,取各组细胞上清液用于生化指标CK、CK-MB和LDH的检测；取各组心肌细胞分别进行组织学、细胞免疫荧光、Western Blot和荧光定量RT-PCR等检测。热应激后H9c2心肌细胞培养液中CK、CK-MB和LDH酶活性显著升高,表明H9c2心肌细胞结构的完整性发生了改变；热应激大鼠血清中CK、CK-MB知LDH酶活性显著升高,并且变化趋势是随着热应激时间的增加而逐渐升高,表明热应激处理后大鼠心脏出现随应激时间延长而加重的应激性损伤。组织学检测结果显示,热应激后H9c2心肌细胞体积急性肿胀,胞浆内出现大量红色颗粒,细胞核深染、个别浓缩；大鼠心肌细胞肿胀,细胞内颗粒变性,横纹逐渐消失,细胞间隙明显增宽,排列紊乱,心肌细胞间毛细血管扩张,充满红细胞,个别区域出现心肌细胞断裂。热应激死亡组大鼠心肌细胞排列明显紊乱,大量心肌细胞断裂,心肌细胞间毛细血管扩张充满红细胞。并且体内外心肌细胞应激性损伤表现出随着热应激时间的持续而逐渐加重的趋势,表明热应激导致大鼠体内外心肌细胞的病理损伤与所检测的酶活性密切相关,因此所检酶活性可以间接反映大鼠体内外组织细胞的应激性病理损伤。免疫组织化学检测结果显示,在对照组和热应激组大鼠体内外心肌细胞中均有Hsc70的表达和分布,且主要分布在细胞浆,不同的是H9c2心肌细胞中Hsc70阳性信号在热应激后减弱,大鼠心肌细胞中Hsc70阳性信号在热应激后增强随后减弱。Hsp72阳性信号只存在于热应激组大鼠体内外心肌细胞中,在体内外对照组中均不存在。在死亡组大鼠Hsc70主要分布于细胞浆中且呈不均匀分布,Hsp72呈颗粒状分布于细胞浆,但阳性信号强度明显低于对照组和热应激未死亡组大鼠。WesternBlot检测结果显示,离体培养H9c2心肌细胞中Hsc70表达量在应激过程中一直低于对照组,并且在热应激处理60 min后,Hsc70的表达量显著降低(P<0.05)；大鼠心肌细胞中Hsc70的表达量在热应激40 min后显著升高(P<0.05),随着应激时间延长其含量又开始降低,在热应激100 min时已显著低于对照组；在死亡组大鼠心肌细胞中Hsc70含量极显著低于对照组(P<0.01),也低于热应激100 min组。离体培养H9c2心肌细胞和大鼠心肌细胞中Hsp72的含量在热应激初期几乎检测不到,但随着热应激时间的延长均显著升高,然而Hsp72在体外培养H9c2心肌细胞中出现的时间早于在大鼠体内心肌细胞中、；在死亡组大鼠Hsp72含量高于对照组,但低于热应激100 min组。荧光定量PCR检测结果显示体内外大鼠心肌细胞hsp70mRNA在热应激后均显著或极显著升高,但在大鼠心肌细胞细胞中Hsp70蛋白表达有迟滞现象；在死亡组大鼠hsp70 mRNA含量高于对照组,但低于热应激100 min组。研究结果表明,HSP70在基因和蛋白表达水平均呈现出显著性变化,揭示HSP70可能在H9c2心肌细胞抵抗热应激损伤中起重要作用,可能参与心肌细胞获得热耐受过程。体外培养H9c2细胞分成对照组、热应激组和siRNA+热应激组。首先对siRNA的基因序列、作用浓度和转染时间进行筛选,确定作为Hsc70基因干涉的最佳条件,然后采用MTT、estern blot和流式细胞仪方法研究Hsc70对热应激H9c2心肌细胞凋亡信号通路的影响。试验结果表明：80 nmol/L FAM-siRNA+1.5μL Lipofectamine2000为最佳转染条件,转染后48 h收获细胞为最佳转染时间,以oligo3为最佳RNAi把基因。MTT结果显示热应激后H9c2心肌细胞活力明显降低,Hsc70抑制表达可降低细胞活力。流式细胞仪检测结果表明,热应激120 min后,细胞凋亡率极显著低于对照组(P<0.01)；Hsc70抑制表达,热应激240 min后热应激+siRNA组细胞凋亡率显著低于热应激组细胞凋亡率(P<0.05)。Western Blot结果显示细胞浆中Hsc70含量在热应激组下降,在热应激+siRNA组中极显著降低(P<0.01); Hsp72含量在热应激+siRNA组显著高于热应激组；热应激后促凋亡基因如cleaved PARP、 AIF、cleaved caspase-3和Bax表达量显著升高,而抗凋亡基因如Bcl-2表达降低,GRP78表达量降低,caspase-12表达量升高,Fas和FADD表达量无明显差异；与热应激组相比Hsc70抑制表达后热应激过程中cleaved PARP、AIF、cleaved caspase-3、Bax和GRP78变化不明显,而caspase-12显著降低,Fas和FADD显著升高。热应激组和热应激+siRNA组中细胞核中Hsc70含量均呈现先升高后降低,siRNA组Hsc70表达量明显高于热应激组；细胞核中Hsp72、AIF和cleaved PARP表达量都升高,siRNA组Hsc70表达量明显高于热应激组。试验结果表明Hsc70抑制表达升高热应激引起的H9c2心肌细胞凋亡率；在热应激引起的细胞凋亡过程中, Hsc70主要通过内质网通路和死亡受体通路发挥作用。