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T细胞膜上电压门控钾通道Kv1.3是治疗自身免疫疾病的新型靶蛋白。当效应T细胞上的Kv1.3表达量异常增高时，可以引起T细胞的异常激活、增殖和分化，这一病理生理变化与自身免疫疾病的发生密切相关，特异性强的Kv1.3阻断剂有望成为治疗自身免疫疾病的先导化合物。蝎子毒腺分泌大量离子通道调节肽，其中Kv1.3通道阻断肽尤其丰富。 本研究提取波氏琵蝎毒腺总RNA，经深圳华大基因公司进行转录组测序，得到一条新的蝎毒素多肽KTX-Sp4编码基因，序列比对表明KTX-Sp4与已报到的Kv1.3通道阻断肽高度同源，提示 KTX-Sp4可能是一种新的Kv1.3通道阻断剂。本课题采用基因工程技术，对KTX-Sp4进行overlap PCR的基因扩增，经酶切、连接、转化，构建了pGEX-4T-1-KTX-Sp4重组表达载体，将重组质粒转入大肠杆菌 E.coli/Rosetta(DE3)中。添加 IPTG进行诱导表达GST-KTX-Sp4融合蛋白，采用GST亲和层析的方法对GST-KTX-Sp4蛋白进行纯化，超滤洗脱盐分并浓缩，运用小肠激酶对GST-KTX-Sp4蛋白切割，经RP-HPLC分离纯化，得到成熟肽KTX-Sp4，结合MALDI-TOF-MS质谱鉴定，测定的KTX-Sp4分子量与理论值基本吻合，表明成功制备出KTX-Sp4成熟肽。采用全细胞膜片钳实验技术，测定KTX-Sp4成熟肽对Kv1.3通道的影响，结果发现KTX-Sp4对外源表达在HEK-293细胞膜上Kv1.3通道电流表现出浓度依赖性抑制作用，100nM的KTX-Sp4对Kv1.3通道电流抑制过半， Hill方程拟合量效曲线得到其半数抑制浓度(IC50)为27.31±11.6nM。为研究KTX-Sp4对Kv1.3通道是否有选择抑制作用，本课题进一步观察KTX-Sp4分别对小鼠背根神经节细胞膜上内源性电压门控性钾通道(DRG Kv)、HEK-293细胞膜上外源性表达的Kv1.1和Kv1.2调节作用。结果发现，即使施加1μM高浓度，KTX-Sp4对DRG Kv、Kv1.1、Kv1.2并没有产生明显的抑制作用，表明KTX-Sp4对Kv1.3通道具有较高的选择性抑制作用。在哺乳动物所有离子通道类型中，Kv1.1和 Kv1.3同源性最高，通道turret区域氨基酸残基差异可以很好解释部分活性多肽对二者的选择性阻断作用。既然KTX-Sp4对Kv1.3的抑制作用显著强于Kv1.1，本课题拟初步从分子水平阐明KTX-Sp4对Kv1.1和Kv1.3通道的选择性作用机制。当将Kv1.1通道turret区域氨基酸残基用Kv1.3通道替换后，KTX-Sp4对turret区域突变的Kv1.1通道（Kv1.1-AEHS/PGSN）表现出了较强的抑制作用，半数抑制浓度IC50达到9.8±3.95nM，与Kv1.3通道的IC50非常接近。结果表明Kv1.1和Kv1.3通道的turret区域氨基酸残基差异决定了KTX-Sp4对二者的选择性识别作用。