论文部分内容阅读
目的:巨噬细胞（macrophage,Mφ）是一类重要的固有免疫细胞,通过吞噬病原体和凋亡细胞（小体）,调节先天性（innate immunity）和获得性（acquired immunity）免疫应答。响应体内不同微环境的刺激,巨噬细胞可极化为经典的1型巨噬细胞（M1）和旁路活化的2型巨噬细胞（M2）。TIM-4（T-cell Immunoglobulinand mucin domain containing protein 4）表达于抗原递呈细胞（antigen presenting cell,APC）主要是巨噬细胞表面。TIM-4的主要功能是作为磷酯酰丝氨酸（Phosphatidylserine,ps）受体,通过清除凋亡的抗原特异性效应T细胞（Teff）等机制,调节免疫应答。micro RNA-21（miR-21）在诱导M1巨噬细胞的极化和调控炎症反应中发挥作用。已知IL-12是M1特征性细胞因子,IL-10是M2特征性细胞因子。IL-35是最近发现的细胞因子,具有强烈的免疫抑制作用。IL-35在M1/M2中的表达及分化发育中的作用尚无公开报道。本研究旨在分析小鼠M1/M2细胞的miR-21及相关细胞因子的表达格局;并通过特异性单克隆抗体（m Ab）阻断小鼠体内TIM-4分子,探讨TIM-4信号对巨噬细胞（M1/M2）极化、miR-21和特征性细胞因子的影响,以及在诱导同种异体移植物免疫耐受中的作用。方法:1.通过M-CSF、IFN-γ、LPS、IL-4、IL-13等因子体外诱导骨髓源巨噬细胞M1（F4/80+CD11b+CD38+）和M2（F4/80+CD11b+CD206+）分化,流式细胞术检测细胞膜表面F4/80、CD11b、CD38和CD206,鉴定M1和M2诱导效果。以荧光定量RT-PCR检测M1和M2型巨噬细胞中特征性因子miR-21、IL-10、IL-12 p35亚单位,IL-12 p40亚单位和IL-35 EBi-3亚单位的表达。2.体外诱导髓源M1和M2（同方法1）,干扰M1中miR-21的表达和过表达（over express）M2中的miR-21。第10天,流式检测M1和M2的百分比。q RT-PCR检测M1/M2中的miR-21、IL-10、IL-12 p35、IL-12 p40和IL-35 EBi-3的变化。3.构建同种异体免疫排斥模型:将BALB/c小鼠脾细胞悬液通过腹腔注射免疫C57BL/6小鼠,以特异性单克隆抗体（anti-TIM-4）腹腔注射阻断抗原提呈细胞（APC）表面TIM-4分子。于第10天,流式检测腹腔和脾脏中M1和M2的比例,以q RT-PCR检测miR-21、IL-10、IL-12p35、IL-12p40和EBi-3的表达。4.构建同种异型皮肤移植模型:将BALB/c小鼠耳部皮肤移植至C57BL/6小鼠背部,并以anti-TIM-4静脉注射。第8天,流式检测腹腔和脾脏中M1和M2比例,以及q RT-PCR检测miR-21、IL-10、IL-12p35、IL-12p40和EBi-3的表达。移植皮肤H-E组织化学染色,病理学检查。每日观察皮肤移植物生存状况,根据皮肤生存时间制作生存曲线（Kaplan-Meier Survival Curve）。结果:1.体外成功诱导骨髓源M1（F4/80+CD11b+CD38+）和M2（F4/80+CD11b+CD206+）。小鼠骨髓细胞体外定向诱导M1/M2后,流式细胞术检测M1/M2阳性率,M1>70%,M2>85%,提示我们已成功诱导出髓源性M1和M2型巨噬细胞。M1呈现炎症细胞因子格局,M2细胞具有免疫抑制性（调节性）细胞因子格局。q RT-PCR结果显示:M1细胞特征性因子miR-21和IL-12均高表达。M2细胞特征性因子IL-10高表达。IL-35（EBi-3亚单位）在M2细胞中的比率（抑制/炎症因子）也显著高于M1,说明IL-35也是潜在的M2特征性细胞因子,这是我们的首创发现,国内外尚无报道。IL-35是M2发挥抑制作用的因素之一。2.干扰miR-21可抑制M1特征性炎症细胞因子IL-12的产生。转染miR-21抑制剂后,M1的比例（%）无显著差别;而其中IL-12的表达明显下降。转染miR-21模拟物对M2细胞的分化无明显作用。转染miR-21的模拟物后,IL-10（抑制性）和IL-12（炎症性）的表达均略微升高。而IL-35的表达无显著差别。3.在小鼠同种异体免疫排斥模型中,经anti-TIM4处理的脾细胞M1%、M2%、无明显变化;但是IL-10、IL-12p35游离亚单位等抑制因子的表达显著升高。经anti-TIM-4处理后腹腔中M2%、IL-10和IL-35的水平均显著升高。因此,anti-TIM-4单抗促进腹腔M2的产生和抑制性细胞因子的表达。4.在小鼠同种异体皮肤移植模型中,anti-TIM-4处理后脾细胞IL-10、IL-35的表达明显升高,腹腔中IL-35/IL-12比例升高。与Rapa+isotype组相比,Rapa+anti-TIM-4组脾细胞IL-10和IL-35表达升高,而miR-21的表达下降。在腹腔中,经Rapa+anti-TIM-4处理小鼠腹腔细胞的M2%、IL-35的表达显著升高,而miR-21和IL-12的表达水平明显下降。在isotype、anti-TIM-4、Rapa、Rapa+isotype和Rapa+anti-TIM-4这五组中,Rapa+anti-TIM-4组,炎性细胞浸润较少和血管结构较为完整（移植皮肤H-E组织化学染色）。根据移植皮肤生存时间,Rapa+anti-TIM-4组皮肤生存时间明显长于其它各组。结论:通过特异性单克隆抗体阻断抗原提呈细胞（APC）表面的TIM-4分子,能够负向影响miR-21的表达,有利于促进调节性M2型Mφ的产生和多种抑制性细胞因子的分泌,减轻同种异体移植排斥反应。