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第一部分METTL16在DNA损伤修复中的作用及其对结直肠癌细胞顺铂化疗敏感性的影响
目的：研究METTL16在双链DNA损伤修复中的功能，并阐明其对结直肠癌细胞顺铂化疗敏感性的影响。
方法：分别敲低以及过表达HEK293T、HCT116、HT29和U2OS细胞系中METTL16的表达后，构建DR-GFP、EJ5-GFP报告系统，采用细胞流式检测细胞DNA损伤修复能力；平板克隆形成实验研究结直肠癌细胞系顺铂化疗的敏感性；中性彗星实验和微核试验检测细胞基因组稳定性；免疫荧光实验探究DNA损伤修复中相关修复蛋白的募集；裸鼠皮下成瘤实验进一步验证敲低METTL16对结直肠细胞系顺铂化疗敏感性的影响。
结果：Western-Blot显示各细胞系中METTL16敲低及过表达效果良好。细胞流式结果发现，敲低METTL16后，细胞HR修复效率显著升高，NHEJ修复效率基本不变；过表达METTL16后，细胞HR修复效率降低。平板克隆结果显示敲低METTL16显著降低结直肠癌细胞系对顺铂的敏感性；过表达METTL16后，结直肠癌细胞对顺铂更加敏感。中性彗星实验和微核试验同时发现敲低METTL16增加细胞基因组稳定性；过表达METTL16降低细胞基因组稳定性。免疫荧光结果显示，敲低METTL16后，DNA修复后期gH2AXfoci显著降低；RAD51、BrdU和RPAfoci显著升高；过表达METTL16后，Foci形成与敲低效果相反。
结论：METTL16抑制细胞HR修复；METTL16可在体外及体内水平促进结直肠癌细胞系对顺铂的敏感性；METTL16抑制HR修复通路中的DNA断链末端切割过程。
第二部分METTL16结合MRN复合体调控DNA损伤修复及结直肠癌细胞顺铂化疗敏感性的机制研究
目的：研究METTL16与HR修复通路中相关蛋白的相互作用以及METTL16影响结直肠癌细胞系顺铂化疗敏感性的分子机制。
方法：在HEK293T细胞中过表达METTL16后，通过免疫共沉淀(Immunocoprecipitation， IP)实验鉴定METTL16与HR修复通路中相关蛋白的相互作用；用pSQ/TQ抗体检测METTL16是否存在磷酸化位点，验证是否为ATM底物。分别用DNA酶或RNA酶处理蛋白裂解液，观察其是否影响METTL16与相应蛋白的相互作用；构建METTL16及其互作蛋白相关结构域缺失突变质粒，研究METTL16及其互作蛋白的作用结构域；构建METTL16甲基转移酶失活突变质粒，观察其是否影响METTL16与相应蛋白的相互作用；利用shRNA敲低内源性METTL16的表达并用其野生型及相应突变质粒转染HEK293T细胞，结直肠癌细胞系以及U2OS细胞回复METTL16的表达，验证转入相应METTL16质粒能否挽救HR修复效率，结直肠癌细胞系对顺铂敏感性以及HR修复过程中相关蛋白Foci的形成；合成U6RNA，体外RNA-pulldown实验进一步验证METTL16以RNA依赖的方式结合靶蛋白。
结果：IP结果发现METTL16能和MRN复合体(MRE11、RAD50和NBS1)相互结合，并且在诱导发生DNA损伤后互作减弱；ATM抑制剂预处理细胞经IR照射后，METTL16与MRE11相互作用未减弱；免疫荧光结果显示敲低METTL16，DNA损伤发生后，MRE11Foci明显增加；采用pSQ/TQ抗体杂交上述IP样品，可发现磷酸化条带。突变METTL16潜在ATM磷酸化位点并行IP发现METTL16S419A突变后，METTL16不能被ATM磷酸化。ATM抑制剂处理转染METTL16野生型或S419A突变质粒细胞后行IP发现，在转染S419A突变质粒细胞中，METTL16与MRE11相互作用未减弱。在敲低METTL16细胞中感染METTL16野生型或S419A突变病毒后，细胞流式结果表明HR修复效率得到挽救；平板克隆结果显示，结直肠癌细胞对顺铂敏感性回复；免疫荧光结果显示，MRE11、RPA以及BrdU的Foci得到挽救。用RNA酶处理细胞裂解液发现METTL16与MRE11的相互作用消失；分别转染METTL16与MRE11结构域突变的质粒，IP结果显示当MRE11的DNA结合域2(DNA binding domain 2, DBD2)缺失突变(MD5突变)以及METTL16的RNA结合域2(RNA binding domain 2, RBD2)缺失突变(MR2突变)后，它们的相互作用消失。在敲低METTL16细胞中过表达METTL16野生型或MR2突变质粒，细胞流式、平板克隆以及免疫荧光发现，METTL16野生型能挽救HR修复效率，顺铂敏感性或相关蛋白Foci，而METTL16MR2突变型无变化。突变失活METTL16甲基转移酶活性后IP结果发现并不影响METTL16与MRE11的相互作用；在敲低METTL16细胞中感染METTL16野生型或R82A突变的病毒，细胞流式、平板克隆以及免疫荧光发现，METTL16野生型以及R82A突变均能挽救HR修复效率，顺铂敏感性或相关蛋白Foci。RNApull-down结果显示，METTL16野生型在IR后与U6snRNA相互作用减弱，但METTL16S419A突变型在IR后与U6snRNA相互作用没变化。
结论：METTL16S419位点在IR后能被ATM磷酸化；METTL16与MRE11分别通过它们的DBD2结构域和RBD2结构域相互结合；METTL16与MRE11的相互作用是RNA介导的；METTL16甲基转移酶活性不影响其与MRE11的相互作用。
第三部分METTL16蛋白自身结构的深入研究
目的：深入研究METTL16蛋白的结构，揭示在IR后其与MRE11结合减弱的深入分子机制
方法：将METTL16蛋白从第300个氨基酸处分成1-300氨基酸的N端以及301-562的C端，分别构建Flag-METTL16N端野生型和MR2突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419A/S419D突变的质粒，同时转染HEK293T细胞，IP实验检测它们的相互作用。利用RNApull-down实验验证大量的GFP-METTL16C端蛋白能否同U6snRNA竞争性结合METTL16的N端。再构建GFP-METTL16-Flag野生型或S419A/S419D突变质粒，利用邻位连接实验(Proximity ligation assay, PLA)研究METTL16蛋白在IR后C端能否向N端折叠；同时借助非变性凝胶电泳检测METTL16在IR前后能否形成二聚体或多聚体。再次构建METTL16R200E/R203E/R204E(3RE)突变质粒，利用IP实验探索METTL16MR2功能结构域中保守携带正电荷的3个精氨酸在其N端和C端相互结合中发挥的作用。
结果：同时转染Flag-METTL16N端质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419A突变质粒，IP结果发现在IR后，METTL16N端和C端野生型相互结合增加。同时转染Flag-METTL16N端野生型或MR2突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419D突变质粒，IP结果显示METTL16N端野生型能和METTL16C端S419D突变质粒相互结合，其余各组几乎不能结合。RNApull-down结果显示大量转入GFP-METTL16C端质粒后，METTL16N端和U6snRNA的结合显著减弱。PLA结果发现在IR后转染METTL16野生型质粒细胞中，Duo-link阳性细胞比例明显增加，而转染METTL16S419A突变质粒的细胞中，Duo-link阳性细胞比例未明显增加。非变性凝胶电泳结果显示在IR前后，METTL16只在75KD左右有一条带。同时转染Flag-METTL16N端野生型或3RE突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型质粒，IP结果发现IR后Flag-METTL16N端野生型蛋白能和GFP-METTL16C端野生型蛋白结合，但Flag-METTL16N端3RE突变蛋白却不能。
结论：METTL16N端及C端在IR后可相互结合；大量的GFP-METTL16C端蛋白能同U6snRNA竞争性结合METTL16的N端；METTL16在细胞中不能形成二聚体或多聚体，IR后，METTL16C端可向N端折叠；METTL16MR2功能结构域中保守携带正电荷的3个精氨酸在其N端和C端相互结合中至关重要。
目的：研究METTL16在双链DNA损伤修复中的功能，并阐明其对结直肠癌细胞顺铂化疗敏感性的影响。
方法：分别敲低以及过表达HEK293T、HCT116、HT29和U2OS细胞系中METTL16的表达后，构建DR-GFP、EJ5-GFP报告系统，采用细胞流式检测细胞DNA损伤修复能力；平板克隆形成实验研究结直肠癌细胞系顺铂化疗的敏感性；中性彗星实验和微核试验检测细胞基因组稳定性；免疫荧光实验探究DNA损伤修复中相关修复蛋白的募集；裸鼠皮下成瘤实验进一步验证敲低METTL16对结直肠细胞系顺铂化疗敏感性的影响。
结果：Western-Blot显示各细胞系中METTL16敲低及过表达效果良好。细胞流式结果发现，敲低METTL16后，细胞HR修复效率显著升高，NHEJ修复效率基本不变；过表达METTL16后，细胞HR修复效率降低。平板克隆结果显示敲低METTL16显著降低结直肠癌细胞系对顺铂的敏感性；过表达METTL16后，结直肠癌细胞对顺铂更加敏感。中性彗星实验和微核试验同时发现敲低METTL16增加细胞基因组稳定性；过表达METTL16降低细胞基因组稳定性。免疫荧光结果显示，敲低METTL16后，DNA修复后期gH2AXfoci显著降低；RAD51、BrdU和RPAfoci显著升高；过表达METTL16后，Foci形成与敲低效果相反。
结论：METTL16抑制细胞HR修复；METTL16可在体外及体内水平促进结直肠癌细胞系对顺铂的敏感性；METTL16抑制HR修复通路中的DNA断链末端切割过程。
第二部分METTL16结合MRN复合体调控DNA损伤修复及结直肠癌细胞顺铂化疗敏感性的机制研究
目的：研究METTL16与HR修复通路中相关蛋白的相互作用以及METTL16影响结直肠癌细胞系顺铂化疗敏感性的分子机制。
方法：在HEK293T细胞中过表达METTL16后，通过免疫共沉淀(Immunocoprecipitation， IP)实验鉴定METTL16与HR修复通路中相关蛋白的相互作用；用pSQ/TQ抗体检测METTL16是否存在磷酸化位点，验证是否为ATM底物。分别用DNA酶或RNA酶处理蛋白裂解液，观察其是否影响METTL16与相应蛋白的相互作用；构建METTL16及其互作蛋白相关结构域缺失突变质粒，研究METTL16及其互作蛋白的作用结构域；构建METTL16甲基转移酶失活突变质粒，观察其是否影响METTL16与相应蛋白的相互作用；利用shRNA敲低内源性METTL16的表达并用其野生型及相应突变质粒转染HEK293T细胞，结直肠癌细胞系以及U2OS细胞回复METTL16的表达，验证转入相应METTL16质粒能否挽救HR修复效率，结直肠癌细胞系对顺铂敏感性以及HR修复过程中相关蛋白Foci的形成；合成U6RNA，体外RNA-pulldown实验进一步验证METTL16以RNA依赖的方式结合靶蛋白。
结果：IP结果发现METTL16能和MRN复合体(MRE11、RAD50和NBS1)相互结合，并且在诱导发生DNA损伤后互作减弱；ATM抑制剂预处理细胞经IR照射后，METTL16与MRE11相互作用未减弱；免疫荧光结果显示敲低METTL16，DNA损伤发生后，MRE11Foci明显增加；采用pSQ/TQ抗体杂交上述IP样品，可发现磷酸化条带。突变METTL16潜在ATM磷酸化位点并行IP发现METTL16S419A突变后，METTL16不能被ATM磷酸化。ATM抑制剂处理转染METTL16野生型或S419A突变质粒细胞后行IP发现，在转染S419A突变质粒细胞中，METTL16与MRE11相互作用未减弱。在敲低METTL16细胞中感染METTL16野生型或S419A突变病毒后，细胞流式结果表明HR修复效率得到挽救；平板克隆结果显示，结直肠癌细胞对顺铂敏感性回复；免疫荧光结果显示，MRE11、RPA以及BrdU的Foci得到挽救。用RNA酶处理细胞裂解液发现METTL16与MRE11的相互作用消失；分别转染METTL16与MRE11结构域突变的质粒，IP结果显示当MRE11的DNA结合域2(DNA binding domain 2, DBD2)缺失突变(MD5突变)以及METTL16的RNA结合域2(RNA binding domain 2, RBD2)缺失突变(MR2突变)后，它们的相互作用消失。在敲低METTL16细胞中过表达METTL16野生型或MR2突变质粒，细胞流式、平板克隆以及免疫荧光发现，METTL16野生型能挽救HR修复效率，顺铂敏感性或相关蛋白Foci，而METTL16MR2突变型无变化。突变失活METTL16甲基转移酶活性后IP结果发现并不影响METTL16与MRE11的相互作用；在敲低METTL16细胞中感染METTL16野生型或R82A突变的病毒，细胞流式、平板克隆以及免疫荧光发现，METTL16野生型以及R82A突变均能挽救HR修复效率，顺铂敏感性或相关蛋白Foci。RNApull-down结果显示，METTL16野生型在IR后与U6snRNA相互作用减弱，但METTL16S419A突变型在IR后与U6snRNA相互作用没变化。
结论：METTL16S419位点在IR后能被ATM磷酸化；METTL16与MRE11分别通过它们的DBD2结构域和RBD2结构域相互结合；METTL16与MRE11的相互作用是RNA介导的；METTL16甲基转移酶活性不影响其与MRE11的相互作用。
第三部分METTL16蛋白自身结构的深入研究
目的：深入研究METTL16蛋白的结构，揭示在IR后其与MRE11结合减弱的深入分子机制
方法：将METTL16蛋白从第300个氨基酸处分成1-300氨基酸的N端以及301-562的C端，分别构建Flag-METTL16N端野生型和MR2突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419A/S419D突变的质粒，同时转染HEK293T细胞，IP实验检测它们的相互作用。利用RNApull-down实验验证大量的GFP-METTL16C端蛋白能否同U6snRNA竞争性结合METTL16的N端。再构建GFP-METTL16-Flag野生型或S419A/S419D突变质粒，利用邻位连接实验(Proximity ligation assay, PLA)研究METTL16蛋白在IR后C端能否向N端折叠；同时借助非变性凝胶电泳检测METTL16在IR前后能否形成二聚体或多聚体。再次构建METTL16R200E/R203E/R204E(3RE)突变质粒，利用IP实验探索METTL16MR2功能结构域中保守携带正电荷的3个精氨酸在其N端和C端相互结合中发挥的作用。
结果：同时转染Flag-METTL16N端质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419A突变质粒，IP结果发现在IR后，METTL16N端和C端野生型相互结合增加。同时转染Flag-METTL16N端野生型或MR2突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型或S419D突变质粒，IP结果显示METTL16N端野生型能和METTL16C端S419D突变质粒相互结合，其余各组几乎不能结合。RNApull-down结果显示大量转入GFP-METTL16C端质粒后，METTL16N端和U6snRNA的结合显著减弱。PLA结果发现在IR后转染METTL16野生型质粒细胞中，Duo-link阳性细胞比例明显增加，而转染METTL16S419A突变质粒的细胞中，Duo-link阳性细胞比例未明显增加。非变性凝胶电泳结果显示在IR前后，METTL16只在75KD左右有一条带。同时转染Flag-METTL16N端野生型或3RE突变质粒以及GFP-METTL16C端野生型质粒，IP结果发现IR后Flag-METTL16N端野生型蛋白能和GFP-METTL16C端野生型蛋白结合，但Flag-METTL16N端3RE突变蛋白却不能。
结论：METTL16N端及C端在IR后可相互结合；大量的GFP-METTL16C端蛋白能同U6snRNA竞争性结合METTL16的N端；METTL16在细胞中不能形成二聚体或多聚体，IR后，METTL16C端可向N端折叠；METTL16MR2功能结构域中保守携带正电荷的3个精氨酸在其N端和C端相互结合中至关重要。