水杨酸(salicylicacid,SA)参与植物多种生长发育过程和对环境的响应,也参与气孔运动的调控。然而,目前关于SA调控气孔运动的作用机制尚未完全清楚。前人研究结果已表明SA能促进病原菌诱导植物叶片乙烯的生成,且SA、乙烯和G蛋白都参与气孔免疫反应;本实验室前期实验结果也表明G蛋白参与乙烯诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,并且信号分子过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)也参与此过程。上述研究现状暗示乙烯和G蛋白可能参与SA调控气孔运动的信号转导过程,但目前关于SA诱导乙烯生物合成的机制、参与SA诱导气孔关闭的乙烯信号转导元件和G蛋白的种类及其与信号分子H202和NO的关系以及H202和NO来源的具体酶学途径仍不清楚。因此本文选用各种拟南芥突变体的叶片为材料,借助气孔开度分析、气相色谱、倒置荧光显微镜和半定量(RT-PCR)等技术与手段,首先研究SA处理对拟南芥叶片乙烯生物合成限速酶(ACC合酶ACS)基因表达和乙烯生成量的影响,明确SA诱导乙烯生物合成的机制;然后通过研究乙烯生物合成抑制剂对SA诱导气孔关闭和乙烯生成量的影响,确定乙烯在SA诱导气孔关闭中的作用;最后通过乙烯信号转导组分突变体和G蛋白不同亚基突变体的气孔开度分析以及保卫细胞内源H202和NO生成的分析,明确参与SA诱导气孔关闭的乙烯信号转导元件、G蛋白亚基的种类以及它们与H202和NO之间的相互关系。本文得到以下主要实验结果和结论:1.以野生型拟南芥叶片为材料,当SA处理浓度为100 μM时诱导气孔关闭最为显著,且该浓度在处理3 h后气孔关闭程度最显著,说明100 μM SA处理3 h是SA诱导拟南芥叶片气孔关闭的最适浓度和处理时间。2.与对照相比,SA处理下拟南芥野生型叶片中ACC合酶基因ACS6和ACS11表达量明显上调,乙烯生成量也显著提高;根据时间过程,SA处理2 h时ACS基因表达和乙烯生成达到峰值,这明显早于SA诱导气孔显著关闭的时间3 h,且SA诱导的气孔关闭和乙烯生成能被ACC合酶抑制剂氨基氧乙酸(AVG)显著抑制,暗示乙烯参与了 SA诱导气孔关闭的信号转导过程,也表明SA通过促进ACS6和ACS11的表达诱导叶片乙烯生成。3.SA与乙烯生物合成前体物质1-氨基-1-羧基环丙烷(ACC)单独或复合处理后能诱导拟南芥野生型和乙烯受体etr2、ers2和ein4突变体叶片气孔关闭,但不能诱导乙烯受体etrl和ersl、铜离子转运体ran1以及乙烯信号转导组分ein2、ein3和arr2突变体的气孔关闭;乙烯信号转导组分ctr1突变体在可见光下气孔显著关闭,SA和ACC处理后气孔开度无明显变化,表明ETR1、ERS1、RAN1、EIN2、EIN3和ARR2作为正调节因子以及CTR1作为负调节因子均参与了乙烯介导SA诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,而乙烯受体ETR2、ERS2和EIN4不参与乙烯介导SA诱导气孔关闭的信号转导过程。4.NADPH 氧化酶的 T-DNA 插入纯合突变体A rtobD、AtrbohF AtrbohD/F 和在SA处理下气孔不能正常关闭,其保卫细胞内H2O2含量也很低。该数据不仅表明H202介导了 SA诱导气孔关闭的信号转导过程,而且进一步表明SA诱导拟南芥保卫细胞H202形成依赖于NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF。5.外源SA能明显诱导拟南芥野生型叶片气孔关闭和保卫细胞NO的生成,但对硝酸还原酶双突变体Nial-2/Niα2-5的气孔开度和NO水平无显著影响;相比于Niαl-2/Niα2-5、Niαl-2和Niα2-1单突变体均部分抑制了 SA诱导气孔关闭和NO生成的效应,但Nial-2比Nia2-1的抑制效应更大。该结果表明Nial和Nia2途径来源的NO都参与SA诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程,且Nial的作用大于Nia2。6.SA能诱导拟南芥野生型、Gβ亚基αgbl和Gγ亚基αggl、αgg2和αgg3的功能缺失突变体的气孔关闭,却对Gα亚基gpαl的功能缺失突变体的气孔开度并无明显影响;外源H2O2、NO不仅能诱导gpal突变体气孔关闭,而且能逆转其在SA处理下的气孔不关闭表型;SA能诱导野生型保卫细胞H202、NO的产生,但不能诱导gpal突变体保卫细胞H2O2、NO的产生,说明Gα亚基GPA1参与SA诱导的拟南芥气孔关闭,且Gα位于H202、NO的上游起作用,而Gβ亚基AGB1和Gγ亚基AGG1、AGG2和AGG3均不参与SA诱导气孔关闭的信号转导过程。7.不管有、无SA,H2O2处理均能诱导铜离子转运体rαnl突变体的气孔关闭,但不能诱导乙烯受体及其信号元件etrl、ersl、ein2、ein3和αrr2突变体的气孔关闭;SA能诱导拟南芥野生型和乙烯信号元件ein2、ein3和αrr2突变体保卫细胞H2O2含量明显增加,而不能诱导rαnl、etrl和ersl突变体保卫细胞H2O2含量增加。结果表明在SA诱导气孔关闭的信号转导途径中ETR1、ERS1和RAN1的作用在H202上游,而H202的信号传递又依赖于乙烯受体ETR1和ERS1以及其下游的乙烯信号转导组分EIN2、EIN3和ARR2。8.不管有、无SA,Gα活化剂霍乱毒素(CTX)都能诱导铜离子转运体突变体rαnl气孔关闭及保卫细胞H2O2形成,但不能诱导乙烯信号转导组分突变体etrl、ersl、ein2、ein3和arr2的气孔关闭,而能诱导其保卫细胞H202形成。这些结果结合上述已表明的乙烯信号转导组分与H202的关系,暗示在SA诱导气孔关闭的信号转导途径中Gα的作用在ETR1、ERS1和RAN1的下游,而在H202以及EIN2、EIN3和ARR2的上游。9.不管有、无SA,外源NO供体硝普钠(SNP)都能诱导rαnl、etrl、ersl、ein2、ein3和αrr2突变体的气孔关闭;SA不能诱导ranl、etrl、ersl、ein2、ein3和arr2突变体保卫细胞NO产生和气孔关闭。这些结果表明SA诱导拟南芥气孔关闭过程中NO的作用在RAN1、ETR1、ERS1、EIN2、EIN3和ARR2的下游。本文结果结合前人已表明的Gα和乙烯信号转导组分在乙烯诱导气孔关闭中的相互关系,从而勾勒出了一个SA诱导拟南芥气孔关闭的信号转导模型,即:植物感受SA信号后ACS6和ACS11表达上调并诱导乙烯生成,乙烯通过其受体ETRI和ERS1以及铜离子转运体RAN1的作用,导致乙烯信号转导负调控因子CTR1的失活从而激活Gα,激活的Gα诱导了 NADPH氧化酶催化H202产生,H202信号的传递依赖乙烯受体ETR1和ERS1及其下游信号转导元件EIN2、EIN3和ARR2,进而诱导NR途径产生NO,最终导致拟南芥气孔关闭。这一发现不仅进一步完善了 SA诱导气孔关闭的信号转导途径,而且明确了 SA、乙烯和G蛋白这三种信号转导途径之间的相互关系。