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研究目的检测慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)肝纤维化患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中脂联素基因启动子甲基化状态及血清脂联素(Adiponectin)水平,研究脂联素基因甲基化与肝纤维化的关系,揭示血清脂联素水平及其基因启动子甲基化在肝纤维化诊治中的临床价值。研究方法1、病例选择：慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的肝纤维化患者40例,其中S1期20人；S2期9人；S3期8人；S4期3人;慢性HBV感染后发生肝硬化患者26例,为2011年3月至2012年2月在山东大学齐鲁医院肝病科住院和门诊患者,肝纤维化病人病理采用肝穿刺活检术所取肝脏组织,依据2007年中华肝脏病学会肝纤维化学组制定的《肝纤维化诊断及疗效评估共识》进行分期。慢性乙型病毒性肝炎及肝硬化诊断符合2010年中华医学会肝病分会及感染分会专家修订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准。正常人10例作为对照,来自健康志愿者。2、实验方法：酶联免疫吸附法(ELISA)测定研究对象外周血清中脂联素、转化生长因子(transforming growth factor β1,TGF-β1)水平及肝纤四项水平；手工法提取人外周血单个核细胞DNA,重亚硫酸盐处理,根据修饰后DNA序列,运用在线MethPrimer软件设计引物,进行甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)来检测标本中脂联素基因片段扩增产物,如用甲基化引物扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化；若用非甲基化引物扩增出片段,则说明该被检测位点不存在甲基化。3、统计学分析：采用SPSS17.0软件包进行结果分析,实验数据用均数土标准差(x±s)表示,组问差异采用两组独立样本资料的t检验或卡方检验,方差分析进行多组间比较,相关分析采用Pearson线性相关分析。以P<0.05为显著性差异,具有统计学意义。结果1.外周血血清脂联素表达：在慢性乙型肝炎患者中,轻度炎症GO-G1期组比中重度炎症(G2-G4)组外周脂联素水平高；轻度肝纤维化(S1期)患者血清脂联素水平与正常对照组无显著性差异,随着肝纤维化进展,中重度纤维化(S2-S4期)阶段,血清脂联素水平比正常对照组及轻度肝纤维化患者组(S1期)均明显降低(P<0.05)。肝硬化患者组外周血脂联素水平明显高于肝纤维化组和正常对照组(P<0.05)2.慢性HBV感染的肝纤维化患者组血清脂联素水平与血清HA(r=-0.549,P<0.01)，PⅢCP(r=-0.581,P<0.01),LN(r=-0.619,P<0.01),IV-C(r=-0.575,P<0.01)水平呈明显负相关(r=0.804,P<0.01)；与ALT水平、AST水平、ALB水平、胆红素水平、PTA.HBV-DNA无明显相关性；在肝纤维化患者组中血清脂联素水平与纤维化分期呈负相关(r=-0.714,P<0.05)3.血清TGF-β1水平：不同时期肝纤维化患者组血清TGF-β1水平均高于正常对照组且随纤维化程度的升高而升高,明显高于正常对照组(P<0.05),但显著低于肝硬化组(P<0.05)；在肝纤维化患者组中血清TGF-β1水平与血清HA,PⅢCP,LN,Ⅳ-C水平呈正相关(rHA=0.458,rLN=0.562,rPⅢCP=0.432,rIV-C=0.616,P<0.01)；与ALT水平、AST水平、HBV-DNA无明显相关性；在肝纤维化患者组中血清TGF-β1水平与纤维化分期呈正相关(r=0.342,P<0.05)。4.慢性HBV感染的肝纤维化患者组血清脂联素水平与血清TGF-β1水平呈明显负相关(r=-0.328,P=0.026)5.肝纤维化患者组与肝硬化患者组相比,脂联素基因启动子甲基化程度明显降低(P<0.05)；肝纤维化患者组与健康对照组相比脂联素基因启动子甲基化程度明显升高(P<0.05)。肝纤维化患者S1期脂联素基因未甲基化率为20%(5/20),甲基化率为75%(15/20)；S2-S4期基因未甲基化率为15%(3/20),甲基化率为85%(17/20)；肝硬化患者组甲基化率为88.5%(23/26),未甲基化率为11.5%(3/26)；正常对照组甲基化率为40%(4/10),未甲基化率为60%(6/10)。肝硬化组、肝纤维化者组、健康对照组脂联素启动子甲基化状态的差异有统计学意义。(X2=10.616,df=3,P=0.014)6.慢性乙型肝炎患者及正常人脂联素基因启动子甲基化组比未甲基化组血清脂联素水平明显降低,有统计学差异(P<0.05)结论1.在肝脏炎症情况下,血清脂联素随炎症程度加重呈明显降低；在肝纤维化患者组血清脂联素水平与肝纤四项指标及纤维化分期呈负相关,与血清TGF-β1浓度呈负相关,提示了脂联素可能参与肝脏炎症和纤维化的发病机制。2.肝纤维化患者组与正常组相比,脂联素基因启动子甲基化程度明显升高(P<0.05),提示脂联素基因启动子甲基化可能与肝纤维化的发生发展有关；脂联素基因启动子甲基化组患者血清脂联素水平明显低于非甲基化组,提示DNA甲基化可能是患者血清脂联素表达降低的内在机制,在调控脂联素基因表达中起着重要作用。