[背景和目的]2018年发布的GLOBOCAN 2018全球癌症统计报告数据显示,肺癌的发病率和死亡率在全球癌症中均位居第一位。中国肺癌的发展趋势与全球肺癌类似,既是发病率最高的肿瘤,也是肿瘤相关死因之首。“宣威地区”在我国乃至世界都是肺癌的高发区,且因宣威肺癌中不吸烟女性肺腺癌的死亡率是中国平均水平的20倍等明显的区域特异性,使其在我国肺癌防治中具有特殊地位。我们课题组前期研究发现,宣威地区肺癌的高发生率和高死亡率与使用当地特殊燃煤引起的室内污染有关,该类室内污染环境可能会导致特异的miRNA谱,进而引起宣威肺癌。我们前期对24对宣威肺癌组织标本进行miRNA芯片检测,发现155条差异表达的miRNA,其中,miR-339-5p是上调表达的miRNA之一,根据已有研究报道,miR-339-5p在大部分肿瘤中的表达低于相对应的正常组织,而在肺癌中仅见一篇相关研究,但其表达出现了不一致结果且并未对miR-339-5p的作用机制进行进一步研究。鉴于以上情况,我们利用癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析发现miR-339-5p在肺腺癌和肺鳞癌中均为高表达,前期细胞实验,我们同样发现miR-339-5p在肺癌细胞株中为高表达。因此,我们提出了几个问题:miR-339-5p在肺癌与正常肺组织中会出现差异表达吗?宣威肺癌和非宣威肺癌中的表达是否不一致?如果存在差异表达,miR-339-5p在肺癌的发生发展中起什么作用?机制又如何?本研究检测非小细胞肺癌(Non Small-Cell Lung Cancer,NSCLC)癌组织和配对正常肺组织以及NSCLC血清和对照中miR-339-5p的表达水平,并分析miR-339-5p与临床因素的关系以及其诊断价值;同时通过体内外实验,探究下调miR-339-5p的表达水平以观察对细胞增殖、迁移、侵袭及裸鼠成瘤的影响;并初步研究miR-339-5p的靶基因及信号通路。通过以上研究探讨miR-339-5p在NSCLC中扮演的角色及其作用机制,以期能够进一步为肺癌的防治诊疗工作拓展新的方法。第一部分miR-339-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床意义[目的]分析组织芯片和TCGA中miR-339-5p表达相关数据,同时检测非小细胞肺癌患者组织样本(癌组织、癌旁)和血清样本(肺癌患者、非癌患者)的miR-339-5p表达水平,分析其表达与临床因素之间的关系,探讨miR-339-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用和临床意义。[方法]1.分析前期芯片数据,探究miR-339-5p在宣威肺腺癌及配对远端正常肺组织中的表达情况。2.分析TCGA数据库数据,探究miR-339-5p在非小细胞肺癌(NSCLC)及正常肺组织中的表达情况。3.qPCR检测63例(30例宣威籍,33例非宣威籍)非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织及其远端正常肺组织中miR-339-5p表达量,分析癌与正常组织的表达情况,结合患者临床病理特征(年龄,性别,吸烟状态,地区,组织学类型,淋巴结转移和分期),对miR-339-5p的表达水平与患者临床病理特征进行相关性分析。最后分析miR-339-5p对肺癌组织的诊断价值。4.qPCR检测104例非小细胞肺癌和50例非癌血清样本中miR-339-5p表达量,探讨其是否适宜作为非小细胞肺癌诊断的血清标记物。[结果]1.前期宣威肺腺癌芯片数据显示,与正常肺组织相比,有155条miRNA出现差异表达(65条上调,90条下调),其中miR-339-5p为上调表达(FC=2.0189,p=0.0001,FDR=0.0017)。2.TCGA数据库数据显示,与正常肺组织相比,肺腺癌(Fold Change=2.334,p=2.618×10-11<0.001)和肺鳞状细胞癌(Fold Change=1.589,p=4.323 ×10-6<0.001)中miR-339-5p的表达均上调。3.在63例(30例宣威籍,33例非宣威籍)NSCLC中,与配对正常肺组织相比,miR-339-5p在癌组织的表达量明显增高(p=0.007<0.01)。临床病理特征分析,miR-339-5p高表达者淋巴结转移率更高(p=0.02<0.05),而miR-339-5p的表达水平与年龄,性别,吸烟状态,地区,组织学类型和分期的相关性分析均无统计学意义(p>0.05)。应用MedCalc软件对肺癌组织中 miR-339-5p 进行 ROC(Receiver Operation Characteristic Curve,受试者工作特征曲线)分析,当截值(cutoffvalue)为0.1195时,miR-339-5p达到最高诊断效率,其敏感性为55.6%,特异性为74.6,AUC(Area Underthe Curve,曲线下面积)为0.639。4.血清miR-339-5p在非小细胞肺癌和非癌对照组中的表达差异无统计学意义(p=0.07>0.05)。[结论]1.miR-339-5p在非小细胞肺癌组织中高表达,且与淋巴结转移有关;miR-339-5p在宣威非小细胞肺癌组织中的表达量与非宣威非小细胞肺癌组织的表达量差异无统计学意义。2.miR-339-5p在肺癌组织的诊断中仅有较低的准确性,对肺癌组织的诊断有一定参考价值。3.miR-339-5p在NSCLC和非癌对照组中血清中的表达无显著差异,其可能不适合作为NSCLC诊断的血清标记物。第二部分 miR-339-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系生物学行为的影响[目的]探索下调miR-339-5p对非小细胞肺癌细胞系SPC-A1、XWLC-05增殖、迁移、侵袭等生物学功能的影响。[方法]1.运用qPCR技术检测正常支气管上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞株SPC-A1、A549、XWLC-05、YTLMC、GLC 的 miR-339-5p 表达量,筛选出 miR-339-5p高表达的肺癌细胞株。2.将miR-339-5p inhibitor转染对SPC-A1、XWLC-05细胞中,测定转染效率,筛选稳定转染的SPC-A1、XWLC-05细胞系,检测细胞增殖、迁移及侵袭能力。[结果]1.与BEAS-2B细胞中miR-339-5p表达水平相比,miR-339-5p在肺癌细胞株SPC-A1、A549、XWLC-05、YTLMC、GLC 中均明显高表达(P<0.05),其中SPC-A1的表达最高。2.成功转染miR-339-5p inhibitor后,与正常组和阴性对照相比,SPC-A1、XWLC-05细胞中的细胞miR-339-5p表达明显下降(p<0.05)。3.肺癌细胞系的生物学功能检测:(1)转染 miR-339-5p inhibitor 能抑制 SPC-A1、XWLC-05 细胞的增殖能力,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)转染 miR-339-5p inhibitor 能抑制 SPC-A1、XWLC-05 细胞的迁移能力,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)转染 miR-339-5p inhibitor 能抑制 SPC-A1、XWLC-05 细胞的侵袭能力,(p<0.05)。[结论]肺癌细胞株 SPC-A1、A549、XWLC-05、YTLMC、GLC 中 miR-339-5p均呈高表达,以SPC-A1最高;下调miR-339-5p可以抑制肺癌细胞SPC-A1、XWLC-05增殖、迁移、侵袭能力。miR-339-5p在非小细胞肺癌的发生发展中可能发挥促进作用,是促癌基因。第三部分mmiR-339-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)体内实验的研究[目的]探讨下调miR-339-5p对非小细胞肺癌细胞SPC-A1裸鼠成瘤的影响。[方法]1.通过慢病毒转染SPC-A1细胞,构建miR-339-5p低表达稳定转染细胞系和阴性对照稳定转染细胞系。2.在裸鼠腋下分别接种空白对照(Control)、阴性对照(NC)和miR-339-5p低表达(miR-339-5p inhibitor)细胞系,观察裸鼠一般情况,测量裸鼠瘤体大小。37天处死裸鼠,测瘤体大小,称瘤体重量。瘤体制成石蜡块,行HE染色,并通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测Ki-67的表达量。[结果]1.慢病毒转染SPC-A1细胞后,荧光显微镜观察细胞的转染效率大于50%,qPCR检测结果显示miR-339-5p在inhibitor组的表达明显低于NC组,差异有统计学意义(p<0.05)。2.在24天后,miR-339-5p低表达(miR-339-5p inhibitor)组瘤体体积小于阴性对照(NC)和空白对照(Control),差异有统计学意义(p<0.05);处死裸鼠后,miR-339-5p低表达(miR-339-5p inhibitor)组瘤体重量轻于阴性对照(NC)和空白对照(Control)组,差异有统计学意义(p<0.05)。3.Ki-67在低表达(miR-339-5p inhibitor)组的表达高于阴性对照(NC)和空白对照(Control)组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]下调miR-339-5p表达可显著抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞裸鼠成瘤能力及使 Ki-67 指数(immunoreactive score,IRS)降低。第四部分BCL6作为miR-339-5p直接基因的研究[目的]探讨BCL6是否为非小细胞肺癌中miR-339-5p的直接靶基因,并分析BCL6在肺癌组织及细胞中的表达情况以及其与预后的关系。[方法]1.生物信息学方法预测miR-339-5p的靶基因。2.荧光素酶报告基因系统检测BCL6是否为miR-339-5p的直接靶基因。3.蛋白印迹(Western blot)检测下调miR-339-5p后,肺癌细胞株SPC-A1中BCL6的表达变化。4.qPCR检测63例非小细胞肺癌(NSCLC)组织和其配对远端正常肺组织中BCL6的表达情况,回归分析其与miR-339-5p表达的相关性。5.利用GEPIA在线芯片数据,分析BCL6在非小细胞肺癌(NSCLC)和正常肺组织的表达情况。6.利用KM plotter软件分析BCL6表达与非小细胞肺癌(NSCLC)预后的关系。[结果]1.生物信息学预测BCL6为miR-339-5p的靶基因。2.荧光素酶报告系统证实miR-339-5p的直接靶基因是BCL6。3.下调SPC-A1细胞中的miR-339-5p表达后,蛋白印迹(Western blot)证实BCL6的表达上调。4.与远端正常肺组织相比,BCL6在63例非小细胞肺癌(NSCLC)中低表达(P<0.05),且与 miR-339-5p 的表达呈负相关(R=0.236,P=0.044<0.05)。5.GEPIA分析结果显示:与正常肺组织相比,BCL6在肺腺癌和肺鳞癌中的表达均为低表达。6.KM plotter分析结果显示:BCL6高表达者总生存期(overall survival,OS)更长(HR=0.71,95%CI:0.6-0.84,p=6.2×10-5<0.001),BCL6 高表达者有无进展生存期(progression-free survival,PFS)延长的趋势(HR=0.77,95%CI:0.58-1.01),然而并未达到统计学差异(p=0.056>0.05)。[结论]miR-339-5p的直接靶基因是BCL6;BCL6在非小细胞肺癌(NSCLC)中低表达,且与miR-339-5p的表达呈负相关,提示miR-339-5p可能通过靶向BCL6来调控非小细胞肺癌(NSCLC)的发生发展。