酒精性肝病(Alcoholic Hepatitis)是一种长期因大量饮酒从而导致的肝脏类疾病。通常脂肪肝为酒精性肝病的初期表现,进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。在我国,酒精性肝病目前是常见的肝脏疾病之一,给人民健康造成了严重的危害。近年来,在同期肝病住院患者中酒精性肝病所占的比例在不断攀升,因此对酒精性肝病的研究就显得尤其重要。枯否细胞(KCs)作为定居在肝脏内的巨噬细胞,在酒精性肝病的发病过程中起到了非常重要的作用。它具有吞噬功能的同时又具有分泌功能,因此它可以利用多种途径对肝脏造成损伤。由于巨噬细胞独特的可塑性和异质性,其可根据外在环境而发生功能和表型的改变。在巨噬细胞对外界做出应答的过程中,作一个为“适应响应性”基因,细胞利用ATF-3(ATF/环磷酸腺苷(cAMP)的反应元件结合蛋白(ATF/CREB)家族的转录因子3),以适应外和/或细胞内的变化。它可以调节巨噬细胞的炎症应答的作用和相关的信号通路,如TLR4及NF-κB,来对炎症起到一个负调控的作用。1.通过建立小鼠酒精性脂肪肝的模型,并采用肝脏原位灌流,分离出形态良好、具有生物学活性的枯否细胞(KCs),研究其在酒精性脂肪肝中的表型改变。采用Lieber-DeCarli液体饮食加一次急性酒精灌胃,建立小鼠酒精性脂肪肝模型。造模周期为16天,于第16天灌胃9小时后处死小鼠,取小鼠肝脏及血清及KCs。检测各组血清谷丙转氨酶/谷草转氨酶(ALT/AST),及肝匀浆及血清中总胆固醇/三酰甘油(tg/tc)水平变化和肝脏病理切片he及油红染色。选取原位灌流的方法分离kcs,流式细胞术分析肝脏内巨噬细胞表型及组成的改变。荧光实时定量pcr(q-pcr)检测组织及提取细胞中各细胞因子水平。alt/ast、tg/tc等反应肝损伤的指标模型组显著高于对照组,he及油红染色结果与之一致,表明小鼠酒精性脂肪肝模型建立成功。肝脏原位灌流每只小鼠细胞得率约在1.5×106~2.0×106个。以小鼠巨噬细胞表面标记分子f4/80及白细胞共同抗原cd45双标设门,流式细胞术分析f4/80和cd45双阳性细胞,在模型中肝脏固有cd68+细胞显著降低,并出现大量的浸润单核细胞。q-pcr结果显示,在肝组织及原代细胞中细胞因子,如肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-6(il-6)、单核细胞趋化蛋白(mcp-1)水平显著升高。小鼠酒精肝模型建立成功,肝脏原位灌流法细胞得率较高,酒精性脂肪肝的发病可能与kcs构成、表型改变,与细胞因子升高介导外周单核细胞浸润有关。2.利用ifn-γ(10ng/ml)+lps(10ng/ml)诱导raw264.7细胞6h,il-4(15ng/ml)诱导raw264.7细胞48h,在细胞上建立m1及m2极化模型。运用westernblot和q-pcr检测诱导分型后的raw264.7细胞,m1及m2各型标志性蛋白inos,arg1的表达水平。q-pcr检测各组tnf-α、tgf-β、il-6、il-10mrna表达水平,elisa检测各组细胞培养上清中il-12及il-10表达水平。westernblot和q-pcr结果显示,ifn-γ(10ng/ml)+lps(10ng/ml)刺激6h后,m1型标志性蛋白inos水平明显升高,tnf-α、il-6mrna水平也明显升高;il-4(15ng/ml)刺激48h后,arg1水平升高且tgf-β、il-10mrna表达水平也明显升高。与此同时,elisa结果显示m1型细胞上清中il-12水平明显升高,而m2型中il-10水平也明显升高。3.atf3对于巨噬细胞极化的影响。通过westernblot检测小鼠酒精性脂肪肝模型肝组织中atf3的表达。westernblot和q-pcr检测raw264.7细胞atf3,stat3以及磷酸化stat3的表达情况,用q-pcr检测tgf-β、il-10mrna表达水平,elisa检测各组细胞培养上清中IL-12及IL-10表达水平。利用LipofectamineTM 2000将特异性ATF3转染到RAW264.7内,下调ATF3的表达,降低其活性。实验结果发现,在小鼠酒精性脂肪肝模型中肝组织ATF3的表达水平明显下降。同时在IFN-γ(10 ng/ml)+LPS(10ng/ml),诱导的M1型及IL-4(15 ng/ml)诱导的M2型RAW264.7细胞中ATF3的表达在M2型中有显著升高,磷酸化STAT3表达水平升高。转染ATF3 siRNA后,明显抑制了M2型的极化,Arg1及磷酸化STAT3表达水平均降低。