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背景急性髓系白血病(AML)是儿童常见的血液系统恶性肿瘤之一。随着对白血病研究的不断深入和新药的开发、利用,以蒽环类抗生素联合阿糖胞苷为基础的联合化疗方案使AML的治疗效果有了显著提高,但耐药和复发依然是影响患者最终治疗效果的重要障碍,其原因是常规的化疗药物不能将白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)完全清除。LSC是存在于白血病患者体内由一群异质性细胞组成的一个极微量的细胞亚群,约占白血病细胞总数的0.1～1.0%。研究表明,无论是在体外长期的细胞培养还是在动物模型体内,LSC都是唯一能引起并维持白血病的细胞群。LSC具有与正常造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)类似的生物学特性,如:具有自我更新、无限增殖、多向分化能力以及细胞表面类似的抗原表达包括CD34+,CD38-,HLA-DR-,CD71-等,但在正常HSC表面表达的CD117,CD90和CD116(GM-CSF Rα)在LSC表面没有表达。CD123仅在AML LSC表面表达,在正常HSC表面不表达。现已公认正常HSC的免疫表型为CD34+/CD38-/CD123-,AML LSC的免疫表型为CD34+/CD38-/CD123+。在非AML病例中所测到的“AML LSC(CD34+/CD38-/CD123+)”我们将其定义为“AML LSC相同表型细胞”(AML LSCimmunophenotype-identical cells,简称AML LSC-IPIC)。白血病微小残留病(minimal residual diseases,MRD)是指白血病患者缓解后,在骨髓中仍存在形态学上难以检测到的白血病细胞。白血病MRD的定量检测对ALL患者预后意义很大,对AML患者预后意义各家报道不一,且尚未阐明MRD水平与LSC含量之间存在何种关系。有关儿童AML LSC含量的测定及AML患儿缓解后LSC含量与MRD之间关系的研究国内外未见报道。本研究采用FCM和直接免疫荧光法标记细胞,测定AML LSC或AML LSC-IPIC在儿童急性白血病患儿骨髓单个核细胞(mononuclear cell,MNC)中的含量,研究AML患儿缓解后LSC含量与MRD水平之间的关联,为指导临床合理治疗AML提供新的监测指标。研究对象与方法1、研究对象从2007年7月到2008年2月来我院的白血病患儿113例次,男:女=2.1:1,中位年龄7.0岁(范围2～15岁),以非肿瘤患儿为阴性对照,共12例,包括特发性血小板减少性紫癜8例,再生障碍性贫血3例,传染性单核细胞增多症1例,男:女=1:1,中位年龄5.5岁(范围1～12岁)。所有标本均在采集后4个小时内进行测定。2、研究方法2.1骨髓MNC分离及单细胞悬液制备:采用淋巴细胞分离液(比重1.077)常规离心分离MNC并计数,用PBS调整细胞浓度至1×10~7/ml,制成单细胞悬液。2.2 MNC染色:取四支流式专用试管,每管分别加入10~6个细胞及1ml灭活人AB血浆,孵育10min以阻断细胞表面Fc受体,PBS洗涤后加入单抗,APC标记试剂加5μl,PE、PerCP标记试剂各20μl,以PE-IgG1、PerCP-IgG1和APC-IgG1作为阴性对照,避光孵育、溶血、洗涤后上流式细胞仪(FACScalibur,FCM,美国Becton Dickinson公司)测定。2.3 AML LSC的测定:采用Cellquest软件获取100000个细胞,根据文献报道的方法进行AML LSC或AML LSC-IPIC分析。2.4 MRD的测定:根据初诊免疫表型获得白血病相关表型(LAIP),并采用该LAIP进行单抗组合和FCM测定分析。结果1、初诊白血病患儿骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的含量11例初诊AML患儿骨髓MNC中AML LSC的中位含量为166(范围14～1459)/10万个,12例初诊ALL患儿和12例非肿瘤对照组患儿骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分别为7(范围0～560)/10万个和0(范围0～6)/10万个。初诊AML组骨髓MNC中AML LSC含量明显高于初诊ALL组和非肿瘤对照组(P均＜0.017),初诊ALL组与非肿瘤对照组骨髓MNC中AML LSC-IPIC含量的差异具有显著性(P＜0.017)。2、缓解期白血病患儿骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的含量39例次缓解AML患儿骨髓MNC中AML LSC的中位含量为6(范围0～41)/10万个,44例次缓解ALL患儿和12例非肿瘤对照组患儿骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分别为10(范围0～105)/10万个和0(范围0～6)/10万个。缓解AML组与缓解ALL组患儿骨髓MNC中AML LSC与AML LSC-IPIC含量差异无显著性(P＞0.017),但缓解AML、ALL组患儿骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC含量均明显高于非肿瘤对照组(P均＜0.017)。3、AML患儿不同时期骨髓MNC中AML LSC的含量11例初诊AML、7例次未缓解AML、39例次缓解AML及12例非肿瘤对照组患儿骨髓MNC中AML LSC或AML LSC-IPIC的中位含量分别为166(范围14～1459)/10万个、36(范围5～224)/10万个、6(范围0～41)/10万个和0(范围0～6)/10万个。初诊AML组与未缓解AML组患儿骨髓MNC中AML LSC含量差异无显著性(P＞0.008);与初诊AML组相比,缓解AML组患儿骨髓MNC中AML LSC含量明显降低(P＜0.008),但还是显著高于非肿瘤对照组(P＜0.008)。4、ALL患儿骨髓MNC中AML LSC-IPIC的含量12例初诊ALL、44例次缓解ALL及12例对照祖患儿骨髓MNC中AML LSC-IPIC的中位含量分别为7(范围0～560)/10万个、10(范围0～105)/10万个和0(范围0～6)/10万个。初诊、缓解ALL组骨髓MNC中AML LSC-IPIC含量的差异无显著性(P＞0.017),但均高于非肿瘤对照组(P均＜0.017)。5、AML患儿缓解后骨髓MNC中AML LSC含量与MRD水平的相关性对同时进行AML LSC和MRD检测的33例次缓解AML病例中AML LSC含量和MRD水平进行相关性分析发现,两者存在显著负相关性(R=-0.466,P=0.006)。结论1、AML LSC存在于初诊AML患儿骨髓细胞中,其含量明显高于初诊ALL和非肿瘤对照组;化疗获缓解后AML LSC含量明显下降,但仍然保留在一定的低水平;2、AML LSC-IPIC也存在于初诊ALL患儿骨髓细胞中,且当ALL获完全缓解时AMLLSC-IPIC含量却没有下降,但非肿瘤对照组标本中AML LSC-IPIC的含量极微;3、AML患儿缓解后骨髓中AML LSC含量和MRD水平之间存在着明显的负相关。