研究背景：各种病因可引起肝脏局部炎症,继而由此导致的以胶原为主的细胞外基质过度沉积,进而形成肝纤维化。肝纤维化是各种慢性肝病发展至肝硬化的必经阶段和中心环节,属于可逆性病变。近年来,有关肝纤维化发病机制的研究已取得了长足的进展,大量研究表明,肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞来源,在肝纤维化形成中起关键性作用。肝纤维化是一个有多种细胞因子和多条细胞信号通路共同参与的复杂病理过程。参与肝纤维化的信号转导通路有：Smad信号通路、JAK/STAT信号通路、NF-κB信号通路以及MAPK信号通路等,其中Smad信号通路是目前研究较为清楚的信号转导通路。有研究显示,动物肝纤维化往往伴随HSC数量进行性增多,Smad3 mRNA表达量显著增高,提示Smad信号通路在肝纤维化发生发展中起着至关重要的作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物界广泛存在的保守防御反应,是近年来发现的一种重要的转录后基因沉默方式,它通过一些小的双链RNA阻断特定基因的表达,诱导mRNA的降解,从而达到“基因沉默”的功效。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein 1, IGFBPrP1)是一种相对分子质量为31 KD的可溶性分泌蛋白。导师刘立新等的研究发现IGFBPrP1可能是肝纤维化发生机制中新的致病因子。肝纤维化患者肝组织中IGFBPrP1的表达与TGFβ1及胶原的表达具有正相关关系。重组IGFBPrP1可诱导HSC活化并使活化的HSC合成ECM增多,而抗IGFBPrP1抗体能减少肝纤维化小鼠肝组织中ECM的沉积,且ECM与Smad3的表达变化具有正相关关系。为了明确IGFBPrP1对ECM的影响是否通过Smad3信号通路来实现,并探讨IGFBPrP1对HSC中TGFβ1表达的影响,设计了本课题。第一部分siRNA Smad3对肝星状细胞Smad3基因表达的影响目的：探讨针对大鼠Smad3基因的siRNA对肝星状细胞Smad3基因表达的影响。方法：1.转染细胞：采用小分子RNA干扰(RNAi)技术,将非特异带荧光标记的siRNA(NC siRNA,与Smad3 mRNA无同源性的21ntsiRNA)转染体外培养的HSC-T6细胞株,并在荧光显微镜下检测转染效率。2.筛选有效的SiRNA:实验分为4组：阴性对照组、2对siRNA组及空白对照组。应用实时定量PCR(RT-PCR)和Western blot法分析siRNA对HSC-T6 Smad3 mRNA及蛋白的阻抑效率。结果：1.将转染后24h的细胞在荧光显微镜下观察,可见绿色荧光,说明转染成功,转染效率约为70%。2.转染48h后,RT-PCR及Western blot检测结果显示,siRNA1, siRNA2转染组对Smad3 mRNA抑制率分别为32%和41%,siRNA2转染组Smad3蛋白表达水平抑制率为61.5%,与阴性对照组相比,差异有显著意义(P<0.01),而siRNAl转染组Smad3蛋白表达水平抑制率为7.5%,与阴性对照组相比无显著差异。提示siRNA2对Smad3表达有较好的抑制效率,以后实验均用siRNA2进行。结论：针对Smad3的siRNA可以有效地抑制HSC-T6细胞株中Smad3 mRNA及蛋白的表达。第二部分IGFBPrP1对沉默了Smad3的肝星状细胞分泌细胞外基质的影响目的：明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1 (IGFBPrPl)是否通过Smad3响HSC分泌细胞外基质。方法：1.选择体外培养的肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立30μg/L IGFBPrPl处理组和空白对照组(加入等量磷酸盐缓冲溶液(PBS)),干预因素处理48h后收集细胞培养上清液,应用Western blot法检测经IGFBPrP1刺激HSC后,上清液中CollagenI和FN的表达。2.选择体外培养的肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立阴性对照组(转染NC siRNA)、Smad3 RNAi组(转染Smad3 siRNA2)、Smad3 RNAi+IGFBPrPl组(Smad3 siRNA2转染24h后,加30μg/L IGFBPrP1作用48h)及IGFBPrP1组(培养液中加30μg／LIGFBPrPl作用48h)。分别提取各组细胞总蛋白并收集培养上清液,采用(?)Vestern blot法检测各组Smad3、Collagen I和FN的表达。结果：1. Western blot结果显示,IGFBPrP1作用于HSC后,Collagen I和FN的表达均较空白对照组显著增高(0.74±0.09 vs 0.53±0.07；0.63±0.07 vs 0.46±0.07,P<0.01),差异具有统计学意义。2. Smad3 RNAi组Smad3的表达较阴性对照组显著降低(0.14±0.02 vs 0.33±0.06,P<0.01)。另一组实验先对HSC-T6进行Smad3 RNA干扰,然后再加入IGFBPrP1进行刺激,Collagen I和FN的表达较IGFBPrP1组明显降低(0.42±0.05 vs 0.74±0.09;0.34±0.06 vs 0.63±0.07,P<0.01)。结论：IGFBPrP1可使ECM的重要组成成分Collagen I和FN的分泌增加,该作用的机制之一是通过Smad3信号通路来实现的。第三部分IGFBPrP1对肝星状细胞TGFβ1表达影响的初探目的：观察胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1 (IGFBPrP1)对HSC中转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1, TGFβ1)表达的影响,以判定IGFBPrP1是否可作为TGFβ1产生的原因之一。方法：选择体外培养的肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立IGFBPrP1 10μg/L 20μg/L、30μg/L处理组和空白对照组(加入等量磷酸盐缓冲溶液(PBS)),干预因素处理24h后收集细胞爬片及培养上清液,采用免疫细胞化学染色观察HSC中TGFβ1的表达变化；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中TGFβ1的含量。同时用Western blot法检测经30μg/L IGFBPrP1刺激HSC后,培养上清液中TGFβ1的表达。结果：免疫细胞化学染色结果显示：各组细胞胞浆内均可见棕黄色或棕褐色颗粒沉积,TGFβ1呈阳性表达。经图像分析显示,IGFBPrP1 10μg/L组(10.90±0.35)、20μg/L组(12.09±0.54)、30μg/L组(11.89±0.32)TGFβ1表达均较空白对照组(7.71±0.63)显著增强,且在一定范围内呈剂量依赖关系。ELISA检测结果显示：TGFβ1在空白对照组已有一定量的分泌,但20μg／L组(169.59±24.87)、30μg／L组(188.34±32.24)TGFβ1的含量仍较空白对照组(136.16±19.52)增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：IGFBPrP1组(0.46±0.05)TGFβ1的表达较空白对照组(0.30±0.02)增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：IGFBPrP1可使体外培养的HSC合成和分泌TGFβ1增加,且在一定剂量范围内随着IGFBPrP1剂量的增加TGFβ1的表达逐渐增强。