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肝纤维化通常源于肝脏的炎症,该进程中肝脏巨噬细胞发挥了促炎和抗炎的双重作用。中脑星形胶质细胞衍生的神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF）已被证明是一种抗炎因子。它主要在肝脏的肝细胞和巨噬细胞表达。本文探究了MANF在肝纤维化和巨噬细胞极化中的作用。我们发现在慢性肝病患者的纤维化肝组织及四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导的肝纤维化野生型（wild type,WT）小鼠肝组织中,MANF的表达显著上调。肝细胞和髓系细胞MANF缺失会显著加重肝纤维化并促进肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）进一步激活。重要的是,与肝细胞特异性MANF敲除(hepatocyte MANF-/-,HKO)小鼠相比,髓系细胞特异性MANF敲除(Myeloid MANF-/-,MKO)小鼠肝脏损伤更为严重。重组人MANF（recombinant human MANF,rh MANF）可以显著减轻CCl4诱导的WT和HKO小鼠的肝脏损伤。此外,MKO增加了Ly6Chi促炎类型巨噬细胞的数量,从而促进HSCs的激活。我们还发现细胞内MANF可以和S100A8相互作用,阻断S100A8/A9异二聚体的形成,从而抑制S100A8/A9诱导的TLR4-NF-κB信号的激活。本研究阐明了MANF的一种负向调控方式,它可以作为TLR4-NF-κB通路上游的“刹车”。MANF正是通过这种方式调控巨噬细胞的分化,从而限制肝纤维化,这也揭示了其在临床治疗肝纤维化中的潜在应用。目的:探究MANF在肝纤维化中的表达、作用及其作用机制。方法:我们收集了慢性肝病患者具有肝纤维化病理特征的肝脏组织,同时构建了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,检测人和小鼠肝组织中MANF的表达水平。通过免疫荧光双标实验确定肝脏中表达MANF的细胞类型。为了探究MANF在肝纤维化中的作用,我们在肝细胞和髓系细胞特异性MANF敲除的基因敲除小鼠上构建纤维化模型,通过病理学染色、AST/ALT生化指标、免疫组化等方法鉴定肝纤维化程度。同时,向肝纤维化小鼠尾静脉注射rh MANF,确定MANF在肝纤维化中的保护作用。通过免疫组化、Western blot、PCR等方法检测了肝纤维化的WT、HKO和MKO小鼠肝脏中HSCs的激活。分离小鼠原代HSCs,体外给予rh MANF处理,进一步确定MANF对于HSCs激活的抑制作用。通过流式细胞术和免疫组化实验检测WT、HKO和MKO小鼠肝脏中巨噬细胞表型的差异。通过Co-IP和蛋白质质谱确定了MANF的相互作用蛋白。最后,我们通过在小鼠的原代腹腔和肝脏巨噬细胞上进行免疫荧光实验进一步确定了MANF的作用机制。结果:1.肝纤维化中MANF的表达显著上调我们检测了肝纤维化患者和小鼠的肝脏组织中MANF的表达,结果显示纤维化的肝组织中的MANF表达显著上调。同时,我们确定了MANF主要在肝脏中的肝细胞和巨噬细胞中表达,而不在HSCs中表达。2.MANF缺失加重CCl4诱导的肝纤维化我们分别在WT、HKO和MKO小鼠上构建了肝纤维化模型。我们发现,与WT小鼠相比,HKO和MKO小鼠的肝重/体重比、脾重/体重比、AST/ALT生化指标显著升高,肝脏胶原积累明显增多,这提示我们肝细胞和髓系细胞敲除MANF会加重肝纤维化。重要的是,我们发现MKO小鼠的肝纤维化最为严重。3.重组人MANF减轻CCl4诱导的肝纤维化我们通过尾静脉给予肝纤维化的WT、HKO和MKO小鼠rh MANF。我们发现rh MANF可以显著抑制WT和HKO小鼠的肝脏损伤、胶原沉积、AST/ALT以及Ⅰ和Ⅲ型胶原的水平。但是,rh MANF处理无法减轻MKO小鼠的肝纤维化程度。4.MANF缺失促进HSCs的激活HSCs的激活是肝纤维化发生的关键诱因。因此,我们检测了肝纤维化的WT、HKO和MKO小鼠肝脏中HSCs激活相关因子的水平。结果显示,与WT小鼠相比,HKO和MKO小鼠肝脏中出现了更多激活的HSCs。其中,MKO组小鼠肝脏中的HSCs的激活最为明显。同时,我们分离了小鼠的原代HSCs,给予不同浓度的rh MANF预处理,使用TNF-α诱导其激活。结果显示,rh MANF预处理后,TNF-α诱导HSCs的激活被显著抑制。5.髓系细胞MANF缺失促进肝脏中Ly6Chi促炎巨噬细胞的极化,从而激活HSCs我们检测了肝纤维化WT、HKO和MKO小鼠血清中炎症因子的水平。结果显示,与WT和HKO小鼠相比,MKO小鼠血清中含有更高水平的TNF-α、IL-1β和CCL2。此外,与WT和HKO小鼠相比,MKO小鼠肝脏中的出现了更高比例的CD11bhiF4/80loLy6Chi的促炎类型的巨噬细胞。之后,我们分离了WT和MKO小鼠肝脏的原代巨噬细胞,使用LPS进行刺激,收集巨噬细胞的细胞培养上清液用于HSCs的培养。结果表明,与WT小鼠巨噬细胞相比,MKO小鼠肝脏巨噬细胞的培养上清液会进一步激活HSCs。此外,我们发现LPS会诱导MKO小鼠肝脏巨噬细胞释放更多的促炎细胞因子。6.MANF与S100A8相互作用抑制TLR4-NF-κB信号通路我们通过蛋白质谱和Co-IP实验确定了MANF可以和S100A8相互作用。肝纤维化中,肝脏和血清中S100A8和S100A9及肝脏中的TLR4的表达显著上调,而髓系细胞MANF缺失会进一步促进它们的表达。我们还发现在巨噬细胞系（RAW264.7）中过表达MANF后,可以减少胞内和胞外S100A8/A9二聚体的形成,并抑制TLR4信号的激活。给予不同浓度rh MANF处理巨噬细胞,低浓度rh MANF（0.02,0.2μg/ml）处理无法破坏S100A8/A9二聚体的形成,只有较高浓度rh MANF（2和20μg/ml）处理才可以发挥作用,这提示我们MANF的竞争作用发生于巨噬细胞内。之后,使用LPS刺激WT和MKO小鼠原代腹腔和肝脏巨噬细胞。与WT小鼠巨噬细胞相比,MKO小鼠巨噬细胞中出现了更为明显的S100A9和TLR4的共定位。结论:综上所述,肝纤维化中MANF的表达显著上调,并保护肝脏免受损伤。肝细胞和髓系细胞MANF缺失会进一步加重CCl4诱导的肝纤维化。人重组MANF蛋白处理可以减轻WT和HKO小鼠的肝纤维化。其中,与肝细胞中的MANF相比,髓系细胞来源的MANF更有助于抑制肝脏炎症和HSCs的激活。此外,髓系细胞MANF缺失促进了肝脏中Ly6Chi型巨噬细胞比例的升高。机制方面,MANF通过与S100A8相互作用,阻断S100A/A9二聚体形成,抑制TLR4信号,从而调控巨噬细胞的表型和功能,抑制肝纤维化。