干燥综合征(Sjogren,s syndrome,SS)是一种慢性自身免疫性疾病,主要受累器官为唾液腺与泪腺,表现为眼干和口干;也可累及皮肤等其他器官等改变;受累器官可出现大量淋巴细胞浸润,血清中可检出多种自身抗体,常伴有高免疫球蛋白血症。目前临床上SS尚没有理想的治疗药物,主要以替代治疗和免疫抑制剂治疗为主。替代治疗无法从根本上治疗SS以及免疫抑制剂存在严重的不良反应,因此临床上需要一种高效低毒的药物。CP-25(苯磺酰芍药苷,Phenylsulfonylpaeoniflorin,代号CP-25)是芍药苷(Paeoniflorin,Pae)经酯化修饰得到的单一成分,起效时间和作用强度均明显优于白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)和Pae。CP-25可以显著抑制T、B淋巴细胞的增殖、降低CD80、CD86、MHC-II、PGE2和TNF-α水平,升高Treg细胞比例显著。但CP-25对SS药效如何尚不清楚。SS主要是外分泌腺腺体的损伤,外分泌液减少,黏蛋白含量降低导致口干、眼干,这是外分泌腺分泌功能减少的典型特点之一。人类颌下腺(human submandibular gland,HSG)细胞是一种发挥主要功能的唾液腺细胞。唾液作为维持口腔清洁与牙齿健康的主要物质,除了水、无机物如金属离子外,还有许多蛋白质等有机物,共同组成了口腔防御系统,诸如溶菌酶、α-淀粉酶、黏蛋白、过氧化物酶、免疫球蛋白、凝集素等。生理条件下,唾液的分泌受交感神经和副交感神经的协同支配。此外,β肾上腺素受体(βadrenergic receptors,βAR)信号可能参与了炎症免疫反应的调节。唾液的分泌也可通过SNS在生理条件下的激活来调节。因此唾液中各种成份及含量的变化可能是SS患病的主要特点之一。非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠是典型的1型糖尿模型小鼠因其具有自发性胰腺损伤的特点。但是由于其在第8-12周龄以后具唾液腺、泪腺损伤的特点,近年来成为研究自发型干燥综合征典型的动物模型。目的:建立NOD/LtJ小鼠自发型干燥综合征动物模型并评估模型的相应指标;明确CP-25对自发型SS动物模型的治疗作用;明确异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)ISO持续作用HSG细胞的功能及相关信号变化情况。方法:根据唾液量和体重情况将NOD/LtJ小鼠随机分配到7组,即模型组,CP-25三个不同剂量组(剂量依次为17.5,35,70mg/kg),TGP,Pae和HCQ组;以ICR小鼠为正常对照组。小鼠全身情况检查;脾、颌下腺及胸腺指数评估;毛果芸香碱刺激唾液腺分泌10min唾液量;H&E染色及评估颌下腺组织病理学评分;CCK-8法检测各组小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖;流式细胞仪检测脾脏T细胞亚群表达;CBA-Kit检测各组小鼠外周血清中IL-4,IL-6,IL-17A,IFN-γ,TNF-α等细胞因子表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定NOD/LtJ小鼠外周血清中抗SSA、抗SSB抗体以及Ig G水平;激光共聚焦法检测颌下腺细胞Th1和Th2细胞亚群水平。体外以HSG细胞为研究对象,将培养的细胞至传代密度,将细胞分为Control组、ISO组、ISO+β1AR拮抗剂CGP20712A组、ISO+β2AR拮抗剂ICI118551组等4组。除正常对照组外,以一定浓度的ISO(10-6 mol/L)作用于HSG细胞,同时在CGP20712A和ICI118551组给予相应的βAR拮抗剂(浓度均为10-6 mol/L),持续作用48h以后检测相应细胞功能和指标。正置显微镜下观察HSG细胞的形态;DMMB法检测硫酸粘多糖(SGAG);激光共聚焦法检测α-淀粉酶表达水平;ANNEXINⅤ/PI法检测细胞凋亡;Western Blot法检测βAR及相关信号分子表达水平。结果:1 CP-25对NOD/LtJ小鼠自发型干燥综合征的治疗作用1.1 NOD/LtJ小鼠全身情况变化NOD/LtJ小鼠毛色开始变黄,体型瘦小,体重均有减轻,有抓挠口唇、舔舌的现象。1.2 CP-25对NOD/LtJ小鼠器官指数的影响NOD/LtJ小鼠颌下腺指数显著升高,胸腺指数明显降低。CP-25(35,70mg/kg)、TGP(70 mg/kg)、HCQ(80mg/kg)均能明显下调颌下腺指数1.3 CP-25对NOD/LtJ小鼠唾液量的影响NOD/LtJ小鼠唾液量明显减少。用药1周后,CP-25(70 mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能明显提高唾液量;用药2周后,CP-25(35,70mg/kg)、TGP(70mg/kg)及HCQ(80mg/kg)组唾液量明显增加。1.4 CP-25对NOD/LtJ小鼠颌下腺病理的影响NOD/LtJ颌下腺病理HE染色均显示出淋巴细胞的浸润,而浸润程度严重,主要表现为淋巴细胞浸润灶数量的增加与面积的增大。CP-25(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能显著降低颌下腺病理分级。1.5 CP-25对NOD/LtJ小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响NOD/LtJ小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖出现明显的升高水平。CP-25(35、70mg/kg)、Pae(70mg/kg)、TGP(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)均抑制了T淋巴细胞的增殖;CP-25(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)明显抑制B淋巴细胞的增殖1.6 CP-25对NOD/LtJ小鼠Th17、Treg细胞亚群的影响NOD/LtJ小鼠Th17细胞比例显著升高,而Treg细胞比例显著降低。CP-25(70mg/kg)、TGP(70mg/kg)、Pae(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能明显下调Th17细胞比例;CP-25(70mg/kg)明显上调Treg细胞比例。1.7 CP-25对NOD/LtJ小鼠血清细胞因子的影响NOD/LtJ小鼠外周血清IL-4,IL-6,IFN-γ和IL-17A水平明显升高。CP-25(70mg/kg)、TGP(70mg/kg)、Pae(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能显著降低NOD/LtJ小鼠血清中IL-6、IL-17A、IFN-γ水平;CP-25(35mg/kg)能显著降低IFN-γ水平。1.8 CP-25对NOD/LtJ小鼠血清中抗SSA抗体、抗SSB抗体水平的影响NOD/LtJ小鼠血清中抗SSA抗体、抗SSB抗体水平明显增加;CP-25(17.5,35,70mg/kg)、TGP(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能明显降低NOD/LtJ小鼠血清抗SSB抗体水平。1.9 CP-25对NOD/LtJ小鼠血清中Ig G水平的影响NOD/LtJ小鼠血清中Ig G水平明显增加;CP-25(70mg/kg)、TGP(70mg/kg)、HCQ(80mg/kg)能明显降低NOD/LtJ小鼠血清Ig G水平。1.10 CP-25对各组小鼠颌下腺组织中Th1和Th2细胞水平的影响在NOD/Ltj小鼠颌下腺组织中Th1和Th2细胞的表达均显著增加。CP-25(70mg/kg)显著降低了Th1和Th2细胞的表达。1.11 HSG细胞在βAR激动剂刺激后功能与相关信号分子的变化⑴HSG细胞在ISO作用下形态学的变化Control组的细胞形态显示为细长或梭状的形态,细胞边界清晰。ISO作用48h之后,细胞形态呈现多边形或变短,细胞边界不清晰。⑵HSG细胞在ISO作用下硫酸粘多糖(SGAG)代谢水平的变化ISO作用48h后HSG细胞释放的SGAG比例明显增加。结果显示,ISO组HSG细胞内粘多糖代谢紊乱。⑶HSG细胞在ISO作用下细胞内α-淀粉酶表达量的变化ISO作用48h后,HSG细胞内α-淀粉酶表达明显下调,提示ISO作用48h后对HSG细胞功能具有一定损伤作用。⑷HSG细胞在ISO作用下细胞凋亡比例的变化ISO作用48h后,ISO组HSG细胞的凋亡水平明显增加,提示β2AR可能参与了HSG细胞的凋亡过程。⑸HSG细胞在ISO作用下β肾上腺素受体及相关信号分子表达情况结果表明,ISO作用48h后,β1AR和β2AR均显著下调,而相应的βAR拮抗剂均拮抗了这一效应,从而上调了β1AR和β2AR的表达量。与Control组相比,ISO组GRK2明显增加而Gαs水平显著下降。结论:1 NOD/LtJ模型小鼠具有自发型SS的特征2 CP-25对NOD/LtJ小鼠SS模型有治疗作用3 CP-25对NOD/LtJ小鼠SS模型的治疗作用与其调节免疫细胞功能、细胞因子水平密切相关4 ISO对HSG细胞功能及相关信号分子的影响:4.1 HSG细胞在ISO作用下发生了形态和功能的改变4.2βAR及其信号分子参与了HSG细胞功能损伤的发生