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萜类化合物(terpenoid)是发现于植物中的一类庞大而多样化的天然有机化合物,它们不但在植物防御、相互沟通以及传粉中起着非常重要生理、生态作用,而且在农业、商业及医药行业中具有重要的应用价值。植物中萜类化合物的合成可分为两条不同的途径,即甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径和2-甲基赤藓糖磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径。萜类合成酶(Terpene synthases,TPS)在萜类化合物的形成过程中起着关键作用。苔藓(Bryophytes)植物是陆地上出现最早的植物,也是现如今继被子植物之后的第二大陆生植物群。苔藓植物中天然化合物的研究结果表明萜类化合物在这些化合物中占有很大比例,很有必要开展苔藓植物中萜类化合物及其合成酶的研究。近年来高通量测序技术的发展以及对苔藓植物中转录组数据的积累,为通过生物信息学和实验手段对苔藓植物中微生物型萜类合成酶基因(Terpene synthases-like gene,TPSL gene)的研究提供了可能。本研究以代表性的苔藓植物为研究对象,首先对前期识别的7个苔藓TPSL基因(LNSF-TPSL1、LNSF-TPSL3、WSPM-TPSL1、IGUH-TPSL1、GOWD-TPSL1、GOWD-TPSL3 和 VBMM-TPSL3)进行进化、序列保守性以及结构域分析;然后通过原核表达验证这些基因表达的蛋白酶活性以及该基因的功能;随后通过定点突变技术得到D232K-LNSF-TPSL1、D198K-WSPM-TPSL1、D190K-IGUH-TPSL1、D198K-LNSF-TPSL3、K190D-GOWD-TPSL1、L198D-GOWD-TPSL3 和 D206K-VBMM-TPSL3 7 个突变基因,并验证了这些突变对基因功能的影响,具体结果如下:1.通过构建进化树以及结构域的分析,发现LNSF-TPSL1、LNSF-TPSL3、WSPM-TPSL1、IGUH-TPSL1和VBMM-TPSL3基因位于TPS-h亚家族分枝上但不属于任何一个TPS亚家族,而且它们的结构域与属于TPS-h亚家族的GOWD-TPSL1 和 GOWD-TPSL3 完全不同。2.构建7个苔藓植物TPSL基因的原核表达载体,并进行原核表达以及GC-MS 分析后,发现 LNSF-TPSL1、WSPM-TPSL1、LNSF-TPSL3、IGUH-TPSL1、GOWD-TPSL1、GOWD-TPSL3以及VBMM-TPSL3基因表达的蛋白与GPP反应后定性分析检测到的化合物有trans-香叶醇、cis-香叶醇和(-)-熏衣草醇。GOWD-TPSL3基因表达的蛋白与(E,E)-FPP反应后可以检测到的化合物只有(+)-橙花叔醇,而VBMM-TPSL3基因表达的蛋白与(E,E)-FPP反应后可以检测到的化合物为(Z)-β-法呢烯和β-红没药烯。这7个苔藓TPSL基因都具有单萜合成酶功能,且GOWD-TPSL3和VBMM-TPSL3这两个基因均具有倍半萜合酶功能。3.为了识别TPSL中的关键氨基酸残基,使用同样的原核表达方法对点突变后的7个苔藓TPSL基因进行了表达,并进行GC-MS检测。D198K-LNSF-TPSL3和D206K-VBMM-TPSL3突变基因表达的蛋白多了催化GPP形成p-薄荷酮和小茴香酮的功能,但是D206K-VBMM-TPSL3突变基因表达的蛋白却失去了催化(E,E)-FPP形成倍半萜化合物的能力;D198K-WSPM-TPSL1表达的蛋白失去了催化GPP形成相应单萜化合物的能力:L198D-GOWD-TPSL3突变基因表达的蛋白酶失去了催化(E,E)-FPP形成倍半萜化合物的能力。因此这7个苔藓TPSL基因所预测的关键氨基酸位点中WSPM-TPSL1和LNSF-TPSL3基因中198位天冬氨酸与其单萜合成酶功能相关,VBMM-TPSL3基因中206位天冬氨酸与其单萜合酶和倍半萜合成酶功能相关,GOWD-TPSL3基因中198位亮氨酸与其倍半萜功能活性相关,其余突变后的氨基酸残基位点均不影响基因的单萜合成酶功能以及倍半萜合酶功能。通过对苔藓植物中TPSL基因功能的研究不仅丰富了 TPS基因的资源,也对TPS基因的进化研究做出了贡献,尽管目前鉴定的苔藓TPSL基因并不是很多,但我们的研究有助于人们对苔藓植物中TPSL基因的进一步了解。