【摘 要】
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目的:阐明磷酸甘油酸激酶1（Phosphoglycerate kinase 1,PGK1）琥珀酰化位点赖氨酸（Lysine,K）15的突变是否会改变PGK1琥珀酰化及PGK1表达水平,并探讨PGK1琥珀酰化是否通过影响血管抑素（angiostatin）/血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）参与急性癫痫发作的可能性研究。方法:1、将大鼠分
【基金项目】
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国家自然科学基金； 贵州省自然科学基金；
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目的:阐明磷酸甘油酸激酶1（Phosphoglycerate kinase 1,PGK1）琥珀酰化位点赖氨酸（Lysine,K）15的突变是否会改变PGK1琥珀酰化及PGK1表达水平,并探讨PGK1琥珀酰化是否通过影响血管抑素（angiostatin）/血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）参与急性癫痫发作的可能性研究。方法:1、将大鼠分为正常组（normal）和氯化锂-皮罗卡品诱导的急性癫痫组（epilepsy,癫痫发作后5min、15min、30min、45min）。在normal组和epilepsy组大鼠中:免疫沉淀方法检测PGK1琥珀酰化的表达变化。免疫印迹方法检测PGK1总蛋白的表达变化;2、（1）构建质粒（分4组）:野生型组（wild type）、载体乱序组（scramble）、PGK1非酰基化组（Mutated lysine 15 to arginine,K15R）,PGK1琥珀酰化组（Mutated lysine 15 to glutamate,K15E）。并分别将质粒转染到人胚胎肾（The human embryonic kidney,HEK293）细胞株中,24-36小时后在显微镜下观察质粒的转染情况,确认转染成功后,48-72h收集细胞;（2）构建慢病毒（分3组）:wild type组、K15R组、K15E组,并将慢病毒转染到大鼠的海马（CA1区）中。转染慢病毒2-3周后观察其转染情况;确认转染成功后进行行为学实验（氯化锂-皮罗卡品诱发急性癫痫大鼠模型）:癫痫发作潜伏期、癫痫大发作次数。（3）在质粒转染成功的细胞和慢病毒转染成功的大鼠中,使用免疫沉淀方法比较PGK1琥珀酰化的表达水平的变化,免疫印迹方法检测PGK1总蛋白的表达水平的变化。在质粒转染成功的细胞中,使用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA）方法检测PGK1酶活性。3、在大鼠急性癫痫造模成功48 h后的海马组织中:免疫印迹方法检测angiostatin蛋白和VEGF蛋白的表达水平的变化。4、在血清中,使用ELISA方法检测S100β含量水平的变化。结果:1、与normal组大鼠相比,epilepsy组大鼠中PGK1琥珀酰化表达水平逐渐降低,且在45min时差异有统计学意义（P＜0.05）。2、（1）构建的质粒和慢病毒分别成功转染于工具细胞（HEK293）和大鼠的海马（CA1区）中。（2）分别在细胞和海马中检测:在转染PGK1的K15R组中,PGK1琥珀酰化表达水平均下降（P＜0.05）;而在转染PGK1的K15E组中,PGK1琥珀酰化表达水平均增加（P＜0.05）。然而,在转染PGK1的K15R组或K15E组中,PGK1总蛋白表达水平均没有变化。在细胞中检测PGK1酶活性:在转染PGK1的K15R组中,PGK11酶活性下降;而在转染PGK1的K15E组中,PGK11酶活性增加（P＜0.05）。（3）与wild type组大鼠相比,K15R组大鼠对氯化锂-皮罗卡品诱导癫痫发作的潜伏期缩短,发作次数增加,而K15E组则相反（P＜0.05）。3、与normal组大鼠相比,epilepsy组大鼠的angiostatin蛋白表达量降低,VEGF蛋白表达量增加（P＜0.05）。与wild type组大鼠相比,K15R组大鼠的angiostatin蛋白表达量降低,VEGF蛋白表达量增加（P＜0.05）;K15E组大鼠的angiostatin蛋白表达量增加,VEGF蛋白表达量下降（P＜0.05）。4、在血清中:与normal组大鼠相比,epilepsy组大鼠的S100β含量增加（P＜0.05）。与wild type组大鼠相比,K15R组大鼠的S100β含量水平增加,K15E组大鼠的S100β含量水平降低（P＜0.05）。结论:PGK1的琥珀酰化位点K15参与急性癫痫发作,其机制可能与影响血脑屏障通透性（angiostatin/VEGF途径）有关。
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