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在动物和真菌的一系列亚细胞活动中,驱动蛋白和动蛋白都能够利用ATP水解所释放的化学能量而沿着微管发生机械运动。植物体中目前还未发现动蛋白家族,但是陆生植物却具有一类能以二聚体形式沿着微管定向运动的驱动蛋白-14(Kinesin-14)家族。该家族中的特异亚家族KCHs(Kinesin Calponin Homology Domain)包含一个马达结构域,两个卷曲螺旋结构域和一个C H结构域。目前研究已知在水稻根部和棉纤维中KCH1是微丝和微管之间的连接子,并具有重要的生物学功能。虽然在拟南芥中已经鉴定出七种KCHs,然而KCHs潜在的生物学功能和生化功能却知之甚少,故而需要对KCHs的生化性质和生物学功能进行深入的研究。此前,本实验室研究发现KCHs家族蛋白在拟南芥的生长和发育阶段存在严重的功能冗余,要了解导致功能冗余的原因有必要获得KCHs的高阶纯合突变体。为此,本研究采用了两种策略,一是在抑制水平良好的T-DNA插入单基因纯合突变体的基础上,经过遗传学筛选获得高阶纯合突变体;二是利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过靶向编辑特定的KCHs基因,结合测序后获得可靠的高阶的纯和突变体系。此外,还研究了KCHs CH结构域的生化功能。主要的研究成果如下:1.利用遗传学杂交法获得了KCH1/2/3/4/5/6/7、KCH1/2/3/5/6/7和KCH1/2/3/4/6/7三种六阶或七阶基因型的纯合突变体。在这些高阶纯合突变体,KCH1、KCH2、KCH4、KCH6、KCH7的抑制水平良好,几乎完全沉默;KCH3和KCH5抑制水平较差,表达量仅为WT的40%。2.以KCH1/2/3/6/7的五阶纯合突变体为背景,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使KCH4第406位碱基‘C’缺失,导致移码突变,最终通过遗传转化和分子鉴定获得了基因型为KCH1/2/3/4/6/7的六阶突变体。3.构建了KCH1(0-178)、KCH2(0-139)、KCH3(0-188)、KCH4(0-162)、KCH6(0-139)、KCH7(0-185)、KCH1(0-466)和KCH7(0-466)八种原核表达载体,并通过原核表达最终获得相应的纯化蛋白。4.体外高速和低速共沉淀分析证明:KCH1(0-466)、KCH4(0-162)、KCH6(0-466)蛋白都能够和F-actin结合,但结合能力有显著差异;KCH4(0-162)的结合能力大于KCH1(0-466)和KCH6(0-466)的结合能力,KCH1(0-466)的结合能力与KCH6(0-466)的结合能力相当。5.将KCH1(0-466)、KCH4(0-162)和KCH6(0-466)分别与F-actin孵育并经鬼笔环肽488染色后,激光共聚焦显微镜观察发现KCH1(0-466)、KCH4(0-162)和KCH6(0-466)都能够使F-actin由丝状结构变成棒状或网状结构。综上所述,本研究成功的建立多种抑制水平良好的KCHs高阶纯合突变体,从而为后续的遗传学、细胞生物学和分子生物学研究提供了必要的遗传材料。此外,首次在体外证明拟南芥KCHs家族蛋白可以和微丝结合并能使其聚合成束,本研究对于了解KCHs的功能与作用机理有重要的学术意义。