研究背景:非冬眠动物在经历废用、失重、缺氧、缺血再灌注、禁食等极端条件时,骨骼肌会发生显著萎缩,并且功能受到极大损害,然而冬眠动物在冬眠期经历相同极端不利条件时,能够相比于非冬眠动物更好的保持骨骼肌的质量和功能。通过研究这种天然的抗萎缩机制,以期寻找到预防骨骼肌萎缩或治疗萎缩的策略。已有研究表明,哺乳动物骨骼肌中快缩肌和慢缩肌是非同质性的,本实验室前期蛋白质组学结果亦证明,在蛋白水平达乌尔黄鼠两种骨骼肌对于长时间的废用有不同的应对策略,并且冬眠期间部分蛋白质的表达水平发生了显著的差异变化,但其上游调控基因仍不明确。因此本研究以小型冬眠哺乳动物达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）为实验对象,探究哪些基因在冬眠黄鼠慢收缩肌,快收缩肌中差异表达,并了解差异表达基因的功能,探究不同骨骼肌之间共同差异表达基因以及特异性差异表达基因的功能。从宏观角度了解冬眠期间骨骼肌中基因表达情况以及差异调控基因及其功能。研究方法:（1）利用RNA-seq技术对黄鼠的不同骨骼肌（比目鱼肌和趾长伸肌）进行测序。（2）利用Gene Ontology和KEGG pathway数据库分析基因功能。（3）RTq PCR检验差异基因表达水平。（4）采用STEM（Short Time-series Expression Miner）进行趋势分析。结果与讨论:（1）差异表达基因筛选:对比目鱼肌和趾长伸肌冬眠期间与夏季组相比较的差异表达基因进行筛选,发现可能在冬眠期间骨骼肌质量和功能的维持中发挥重要作用的组间共同差异表达基因6个:Gsc2、Nrip3、Mybph、Fosb、Il1b和Egr1,其中Mybph从未在冬眠动物骨骼肌中被报道;比目鱼肌特异性差异表达基因4个:Chac1、Drd2、Gdf6和prkcb,趾长伸肌特异性差异表达基因4个:angptl4、angptl5、Fndc11和Mmp1,证明不同骨骼肌纤维类型存在不同的差异调控基因。（2）GO富集分析2.1共同差异表达基因:富集到了323个GO条目中,其中上调基因在蛋白质合成与降解相关功能均有富集,提示在冬眠期间骨骼肌相关蛋白的合成和降解可能都有发生;下调的基因主要富集到对外界刺激的响应,这与冬眠期间黄鼠对外界环境以及细胞对刺激的敏感性降低相一致,同时富集到了骨骼肌生长发育相关功能,提示冬眠期机体为了生存而牺牲了一些非急需功能的消耗。2.2比目鱼肌特异性差异表达基因:富集到了466个GO条目上,上调差异基因主要富集到了抗氧化相关,代谢相关功能基因;下调基因富集到了蛋白质合成、蛋白质降解和磷酸化,凋亡等相关功能基因,特异性差异表达基因提示比目鱼肌主要是通过同时抑制蛋白质合成和降解以及凋亡等相关基因来维持骨骼肌质量与功能。同时,上下调的差异表达基因在免疫相关功能上均有富集,提示免疫系统不同组分在冬眠期的反应可能不同,我们后续会对此进行研究。2.3趾长伸肌特异性差异表达基因:富集到了475个GO条目上,上调差异基因在蛋白质合成与降解、离子转运和多细胞生物发育的功能条目均有富集,同时下调基因富集到了代谢、自噬、凋亡和骨骼肌结构相关功能。推测冬眠期趾长伸肌在较高水平维持蛋白质合成与降解速率的平衡,同时通过抑制自噬和凋亡来维持骨骼肌质量和功能。（3）KEGG富集分析3.1共同差异表达基因:富集到了59条信号通路上,上调基因在蛋白质合成和蛋白降解相关通路上均有富集,下调基因富集到了NF-κB和凋亡相关通路。KEGG分析也提示我们达乌尔黄鼠冬眠期间比目鱼肌和趾长伸肌中蛋白质合成和降解相关通路均有富集,这一结果与GO富集分析的结果相一致。3.2比目鱼肌特异性差异表达基因:富集到了62条信号通路上,上调基因富集到HIF-1信号通路,HIF-1能够对低氧条件做出反应,上调多种增强耐缺氧能力基因的转录,上调HIF-1能够保护骨骼肌不受低氧胁迫从而避免发生损伤,下调基因富集到NF-κB、Ras和细胞凋亡信号通路,通过抑制蛋白质合成和降解,来维持骨骼肌质量与功能。3.3趾长伸肌特异性差异表达基因:富集到了37条信号通路上,上调基因富集在PI3K/Akt、蛋白酶体和过氧化物酶通路,下调基因富集在代谢相关、MAPK和钙离子信号通路。PI3K/Akt通路是最主要的蛋白质合成通路;过氧化物酶通路,能够促进肌纤维类型Ⅱ型向Ⅰ型转换,与我们之前研究结果也相符,同时肌纤维类型向Ⅰ型转变能够提高其氧化能力,来适应冬眠期间的低氧胁迫;上调基因同时富集到了主要的蛋白质降解通路蛋白酶体信号通路;下调基因富集在代谢相关,这与冬眠期间低代谢生理状态相符合,同时下调基因在钙离子信号通路也发生富集,推测冬眠期趾长伸肌蛋白质降解水平下调是因为由钙超载激活的钙蛋白酶信号通路受到抑制。（4）qRT-PCR结果:在共同差异表达基因中验证了Mybph,Mustn1,Nrip3和Egr1,在比目鱼肌特异性差异表达基因中验证了Chac1和prkcb,在趾长伸肌特异性差异表达基因中验证了Angptl5和Stc1,这8个基因表达趋势与RNA-seq结果均相符,说明我们的RNA-seq结果真实可靠。（5）趋势分析5.1趋势分析差异基因:通过对比目鱼肌和趾长伸肌进行趋势分析,分别得到了9个和11个显著富集趋势,对在冬眠期持续上调基因的显著趋势模块profile11,通过对两块肌肉的profile11进行韦恩分析,得到了可能对维持骨骼肌质量和功能相关有的一定作用的基因:Clcf1、Kng1、S1pr5、Map6和Ihh。5.2 GO分析:对两块肌肉中显著趋势模块profile11中的基因进行GO分析,分析得到与能量代谢相关、免疫相关、蛋白质合成和降解等相关功能方面均有富集;比目鱼肌富集到了抑制凋亡和蛋白质水解相关功能上;趾长伸肌富集到了骨骼肌重塑相关功能。5.3 KEGG通路分析:比目鱼肌和趾长伸肌都富集于活性配体受体相互作用通路,该通路主要起基础调控作用,对该通路中差异表达基因进行具体分析,鞘氨醇-1-磷酸受体5（S1pr5）基因在两块肌肉中均有表达,其能够调节胚胎发育和促进血管发育,并且有研究表明S1P在冬眠期间能够调节小型哺乳动物的淋巴细胞数量,我们推测该基因的表达有利于冬眠期间骨骼肌中血管的发育,促进血管再生,并且与提高自身免疫相关,从而多方面保护骨骼肌。综上所述,首先,本研究发现在黄鼠冬眠期间骨骼肌中从未报道的基因Mybph,与肌肉生长相关同时能影响肌动蛋白-肌球蛋白作用,其可能在冬眠期间骨骼肌质量和功能的维持中发挥重要作用。其次,冬眠期间,黄鼠两种骨骼肌抗萎缩机制并不相同。根据差异表达基因分析,比目鱼肌和趾长伸肌蛋白质合成和降解相关基因在冬眠期间均有上调,但不同的是,在比目鱼肌特异性差异表达基因分析中发现蛋白质磷酸化以及酶活相关基因均受到了抑制,趾长伸肌则没有;比目鱼肌特异性差异表达的基因主要包括抗氧化以及抑癌相关基因,同时抑制Ras信号通路介导的蛋白质合成和通过抑制NF-κB介导的蛋白质降解以及抑制磷酸化相关基因,来维持骨骼肌质量与功能;趾长伸肌中特异性差异表达的基因中通过上调PI3K/Akt信号通路来促进蛋白质合成,同时通过上调蛋白酶体信号通路,提高了蛋白质降解速率,与此同时上调了过氧化物酶信号通路来实现趾长伸肌中的肌纤维类型转换,提高其抗氧化能力。两种典型的骨骼肌通过调控不同的基因以及通路来维持骨骼肌质量与功能。