猪圆环病毒2型的Cap蛋白表达、单克隆抗体制备及病毒体外感染单核源细胞的研究

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猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪圆环病毒病(PCVAD)感染已遍布世界各国,引起十分严重的经济损失。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到抑制,产生继发感染,导致严重的临床疾病的发生。由于PCV2感染常以亚临床感染的形式出现,较易被忽视,诸多不确定性的因素给PCV2及其相关疾病的研究带来一定困难,故建立PCV2病毒的系列研究方法和手段,为该病毒的研究、诊断及预防奠定基础。猪圆环病毒2型基因组为单链环状共价闭合的DNA,故此得名圆环病毒,而命名2型是因为其基因组不同于原来发现的一种猪圆环病毒(PCV1),病毒粒子无囊膜,直径17nm左右,对外界环境抵抗性强。PCV2基因组大小为1766~1769bp,有两个较大的开放阅读框,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中衣壳蛋白有较好的免疫原性,故开展PCV2的Cap蛋白的表达及研究对PCV2的诊断方法及疫苗研发均有重大意义。本研究采用PCR技术对所收集的45份病料进行检测,得到13份PCV2阳性病料。并从北京、吉林九台两地疑似PCV2感染猪体内分离到2株病毒,进行了全基因克隆,经鉴定为PCV2,分别命名为PCV2-BJ和PCV2-JL。对阳性病料及分离株共6株猪圆环病毒2型(PCV2)进行全基因的扩增、克隆和测序,得到全基因序列,并构建了PCV2的系统发育进化树。为掌握PCV病毒感染情况和可能引起PCV病毒扩散的传播媒介,以及病毒在宿主体内的载量及分布规律,本研究通过对Genbank登陆的和本研究测序所得PCV1及PCV2序列进行了比对,分别建立了两型病毒的荧光定量PCR方法,结果表明建立的两型病毒的荧光定量PCR方法均特异、敏感以及重复性良好,为病毒检测及定量提供了必要的手段。根据分离PCV2病毒的基因组序列,并结合Bac-to-Bac表达系统的特性,设计了一对扩增PCV2的ORF2基因的特异性引物,并在引物两端引入合适的酶切位点,将PCV2的目的基因引入穿梭质粒,将构建好的穿梭质粒转化带有Bacmid的DH10Bac感受态后,筛选得到重组杆转病毒质粒rBac-PCV2-ORF2,转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBac-Cap,Western-Blot实验及间接免疫荧光证实有rCap蛋白的表达,结果表明成功构建了杆转病毒表达PCV2病毒Cap蛋白系统。以纯化的PCV2为抗原,免疫Balb/c小鼠,取多次免疫后的鼠脾细胞与鼠瘤细胞系SP2/0融合,然后以杆状病毒表达的Cap蛋白为筛选抗原,用间接ELISA方法筛选杂交阳性的瘤细胞,经有限稀释法亚克隆后,得到两株杂交瘤细胞。并对杂交瘤细胞制备的腹水单抗进行了亚型鉴定、效价测定及间接免疫荧光分析,结果表明成功制备了针对PCV2的Cap蛋白的单克隆抗体,为PCV2相关研究奠定了基础。由于猪源外周血单核细胞(pPBMC)的易于取材,试验条件容易操控的优点,本研究采用体外感染pPBMC的方法,检测PCV2感染后PBMC的趋化因子的mRNA表达的受影响情况,实验证实PCV2感染后LPS诱导的pPBMC的趋化能力受到抑制,为PCV2的体外感染试验研究提供了很好的模型。为研究PCV2感染后猪源树突状细胞的趋化能力,将PCV2病毒感染体外制备的单核细胞衍生的树突状细胞,并用建立定量PCR方法检测趋化因子的mRNA表达受影响情况,结果表明,PCV2病毒抑制了树突状细胞趋化因子受体CCR7的诱导表达,为进一步阐明PCV2的免疫抑制机理提供理论参考。
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