目的:胰腺癌这一毁灭性的疾病5年总生存率不到5%,由于癌症早期侵袭或转移性复发,根治患者的5年生存率也只有18%,被称为“癌中之王”。因此,更好地了解胰腺癌发生及复发的潜在机制,寻找新的治疗靶向成为临床亟待解决的课题。肿瘤细胞存在糖代谢异常。癌细胞增殖过快,导致细胞处于缺氧状态,使癌细胞倾向于关闭需要线粒体的有氧氧化途径,而更多地依赖葡萄糖的无氧酵解来提供能量。基于胰腺组织学的特殊性,近来多项研究证实糖尿病与胰腺癌的发生、发展密切相关。糖代谢异常已经作为胰腺癌早期诊断和预后判断的重要线索。同时,糖代谢异常带来对常规治疗方法的抵抗。这些都促使我们探索基于调控糖代谢异常的新的机制和治疗方案。低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factors1α,HIF-1α）及其上游因子是公认的肿瘤细胞糖代谢的重要调控因子。在乏氧等细胞外刺激的条件下,HIF-1α在胞浆中表达增多、活化,继而转移入核,结合相应的靶序列,调节糖代谢相关转录因子PGK、GLUT、LDH等的基因表达,从而调控糖代谢。体外实验证实信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）/MAPK信号转导通路的活化是调节HIF-1α活性的重要途径。研究表明EGFR通过ERK1/2途径及NF-κB途径调控PKM2来影响肿瘤糖代谢,且后者由HIF-1α介导。我们研究小组在前期研究中证实EGFR通过MAPK/MEK/ERK途径调控原代培养的胰腺癌细胞的解离状态从而影响细胞的侵袭转移能力。提示了EGFR/MEK/ERK/HIF-1α为调节胰腺癌糖代谢的可能途径,但在胰腺癌中EGFR如何通过MAPK/MEK/ERK途径参与HIF-1α介导的肿瘤细胞糖代谢,从而影响其侵袭转移能力尚无报道。本研究中我们将探讨EGFR/MEK/ERK途径的激活是否及如何参与HIF-1α介导的胰腺癌糖代谢的调节,对不同糖代谢水平背景下的胰腺癌,单独或联合调控EGFR,HIF-1α是否影响胰腺癌细胞糖代谢水平,进而影响其侵袭转移特性,EGFR和HIF-1α是否为潜在的纠正胰腺癌糖代谢异常的治疗靶点。材料和方法:1、研究对象:由本研究团队自行原代培养的仓鼠胰腺癌细胞系PC1（低解离,低转移型）,PC1.0（高解离,高转移型）;临床住院患者中有PETCT结果胰腺癌者45例,同时收集患者的住院资料信息。解析数据,按PETCT检查结果¹⁸F-FDG浓聚SUVmax值分组,取高代谢6例,低代谢6例行组织学实验。2、研究方法:（1）细胞常氧及乏氧培养:常规原代培养两种胰腺癌细胞株,将细胞置于37℃、0.5%O₂,94.5%N₂,5%CO₂的乏氧培养箱中建立乏氧模型。（2）细胞处理及分组:转染SiRNA沉默PC1.0细胞中HIF-1α的表达,转染后,重新铺细胞,用10μM AG1478处理后分为如下六组:对照组;NC转染组;HIF-1αSiRNA转染组;AG1478组;NC+AG1478组;HIF-1αsiRNA+AG1478组。（3）糖代谢水平检测:2-NBDG摄取实验评价糖代谢水平,荧光酶标仪（激发波长488 nm,发射波长520nm）检测各组细胞的荧光强度;乳酸检测实验按乳酸检测试剂盒说明书操作检测各组细胞乳酸生成量。（4）蛋白表达检测（western、免疫组织化学）检测各组细胞EGFR,p-EGFR,p-MEK1/2,p-ERK1/2,HIF-1α,GLUT1蛋白表达水平。（5）氧化应激检测（ROS）:DCF-DA荧光染色,流式细胞仪解析ROS产生量。（6）细胞增殖及侵袭转移能力检测（MTT,划痕实验,Transwell实验）。MTT实验:第一天到第五天每24h进行检测,用酶标仪检测和计算各孔波长570nm的吸光值,统计处理做生长曲线观察各组细胞增殖情况;细胞划痕实验:细胞融合后制作细胞伤口模型,无血清培养基继续培养至3h,6h,12h,30h取出细胞,显微镜下拍照,观察细胞迁徙情况;Transwell实验:Matrigel包被Transwell小室,分别取各组细胞悬液加入上室,相应的培养条件培养48h后4%多聚甲醛固定,0.5%结晶紫染液染色,显微镜下计数迁移至微孔膜下层的细胞数。重复计数5个视野的细胞个数取均数,评价细胞的转移能力。3、统计学处理:数据以均数±标准差或中位数与四分位数表示,服从正态分布的数据的两组间均值比较采用t检验,多组间均值比较使用单因素方差分析（ANOVA）,Dunnett’s test进行多组间的比较,数据分析使用GraphPad Prism5.0（GraphPad Software）统计软件完成。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1、不同胰腺癌细胞株和不同¹⁸F-FDG浓聚水平的胰腺癌患者标本中的糖代谢水平存在差异。高解离状态的PC1.0细胞中,2-NBDG摄取量增多,乳酸分泌量增多;高¹⁸F-FDG浓聚水平的胰腺癌患者标本中GLUT1表达增多。2、糖代谢水平差异与胰腺癌细胞增殖和肿瘤的分期及侵袭转移相关。高糖代谢的胰腺癌细胞株PC1.0增殖快,迁徙能力强;高糖代谢的胰腺癌患者免疫组化结果提示增殖标记物ki-67表达增加。在高糖代谢和低糖代谢两组标本中,肿瘤的分期分级及转移程度有具有统计学意义的差异。3、不同糖代谢水平的细胞株及患者标本间,EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路相关因子表达水平有差异。在高糖的胰腺癌细胞和胰腺癌组织中,EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路参与对肿瘤细胞糖代谢的调控。在高转移细胞中EGFR、MEK、ERK等相关因子的磷酸化水平与HIF-1α同步上调,且与糖代谢水平及乳酸生成水平呈正相关。4、氧化应激机制参与EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路对糖代谢的调节。EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路活化的高糖代谢胰腺癌细胞株ROS水平低,ROS抑制剂进一步提高EGFR表达水平。5、抑制EGFR及HIF-1α可削弱EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路对糖代谢的调节作用,从而调控胰腺癌细胞的增殖,侵袭和转移。在高转移细胞株中下调EGFR,下调HIF-1α及两者联合下调不同程度抑制肿瘤细胞糖代谢水平,2-NBDG摄取量减少,乳酸分泌量减少;不同程度抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。结论:1、EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路在高糖代谢水平的胰腺癌细胞和组织标本中表达上调。2、EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路的活跃与糖代谢水平的提高及胰腺癌细胞的侵袭转移能力、患者的预后相关。3、氧化应激参与了EGFR/MEK/ERK/HIF-1α通路对糖代谢的调节,低氧条件下HIF-1α的上调阻碍了ROS的过度升高,降低的ROS水平又进一步激活EGFR,形成反馈环路。4、在高转移细胞株中下调EGFR,下调HIF-1α及两者联合下调,不同程度抑制胰腺癌细胞糖代谢水平,进而抑制细胞的侵袭和转移,EGFR和HIF-1α可作潜在的纠正胰腺癌糖代谢异常的治疗靶点进一步研究。