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背景与目的： 右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性的α2肾上腺素受体(α2-AR)激动剂,具有中枢性抗交感和抗焦虑作用,因其具有一定的镇痛作用,且对呼吸无明显抑制,对心、肾和脑等器官功能可能具有一定的保护性,临床上常作为镇静镇痛药.研究显示DEX对炎性疼痛、术后疼痛及神经病理性疼痛等多种疼痛模型都有镇痛作用,但镇痛机制没有完全明确. 当外周炎症或者神经损伤后,脊髓胶质细胞激活并释放活性递质,在疼痛发生维持过程中起到了关键的作用.前期我们的研究指出：①鞘内或腹腔内给予DEX均可以抑制单关节炎大鼠致炎侧后爪的热痛觉敏感;②第一次指出右美托咪定(DEX)通过作用于α2A肾上腺素受体(α2A-AR)抑制脊髓胶质细胞激活发挥其镇痛作用;③在背根神经结(DRG)、脊髓神经元、胶质细胞上都检测到了α2A-AR.那么DEX抑制炎性痛是仅仅作用于α2A-AR影响下游通路,还是对其它通路也有影响,目前尚不清楚. TLR4受体属于模式识别受体,它的激活与一些免疫和炎症疾病相关,当它与内源性或外源性配体结合后,通过激活NF-KB通路,产生大量的促炎症因子.有证据表明在中枢神经系统中胶质细胞表达TLR4受体,并且参与到促炎症因子的释放.最近有研究发现,TLR4受体在人的三叉神经疼痛感受器中有所表达,它的激活可使感觉神经元检测到组织中细菌质的水平,并做出应答.这些结果显示TLR4受体在感染引起的疼痛中起到关键作用. 单关节炎痛是典型的慢性炎性痛的代表,与前期研究相同,本研究应用大鼠踝关节腔内注射完全弗氏佐剂(Complete Freunds Adjuvant,CFA)诱发的单关节炎(Monoarthritis,MA)模型,采用伤害性热辐射刺激和机械刺激来进行行为学检测,酶联免疫吸附试验来检测炎症因子表达,免疫荧光共标、免疫荧光组织化学及免疫共沉淀为α2A-AR和TLR4相互作用提供基础,蛋白质印迹检测脊髓GFAP,TLR4表达量,研究DEX抑制炎性痛是作用于α2A-AR后引起TLR4及其下游变化还是直接作用于TLR4及其下游. 方法： 一、检测DEX和EGCG对单关节炎大鼠痛敏的影响 构建大鼠单关节炎模型,利用Von Frey技术和Hargreaves技术分别检测造模后1d、3d、5d、7d等不同时间点大鼠致炎侧的缩腿反应潜伏期(PWL)和缩腿反应阈值(PWT),从而明确DEX和EGCG对单关节炎大鼠致炎侧痛敏的影响. 二、研究单关节炎大鼠脊髓背角GFAP及TLR4的表达水平 构建大鼠单关节炎模型,取造模后3d和7d致炎侧脊髓背角组织,运用Western Blot技术检测致炎侧脊髓背角GFAP及TLR4的表达水平,研究DEX和EGCG对单关节炎大鼠致炎侧脊髓背角GFAP及TLR4表达水平的影响. 三、检测单关节炎大鼠脊髓背角磷酸化NF-κB-p65的表达及活化情况 构建大鼠单关节炎模型,运用Western Blot技术检测3d和7d致炎侧脊髓背角磷酸化NF-κB-p65的表达情况,运用免疫荧光组织化学技术检测3d致炎侧脊髓背角磷酸化NF-κB-p65的活化情况.研究DEX和EGCG对单关节炎大鼠致炎侧脊髓背角磷酸化NF-κB-p65表达及活化情况的影响. 四、检测单关节炎大鼠脊髓背角致炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平 构建大鼠单关节炎模型,运用Elisa技术检测3d和7d致炎侧脊髓背角致炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平.研究DEX和EGCG对单关节炎大鼠致炎侧脊髓背角致炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平的影响. 五、检测α2A-AR与TLR4的相互作用关系 构建大鼠单关节炎模型,取造模后第3d致炎侧脊髓背角组织,运用免疫共沉淀(Co-IP)技术检验α2AAR和TLR4是否存在相互作用. 结果： 1.大鼠单关节炎造模后第1d就出现稳定的痛觉过敏反应,并且可以维持7d.鞘内连续3d注射DEX(2.5μg)可以明显延长CFA大鼠致炎侧热刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)和机械刺激抬腿反应阈值(paw withdrawal threshold,PWT),且不影响MA大鼠非致炎侧和假手术组致炎侧的PWLs及PWTs.MA大鼠连续3d鞘内给予DEX(2.5μg),可以显著缓解致炎后第1d到第7d炎症诱发的痛觉敏化.且上述效果都可以被鞘内连续3d预处理特异性拮抗剂BRL44408所逆转. 2.痛觉敏感形成后,致炎侧脊髓背角的星胶增殖,并且免疫组化结果提示：星形胶质细胞标志物胶质原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)在致炎第3d就明显上调.鞘内连续3d应用DEX(2.5μg)可显著抑制炎症反应导致的脊髓背角星形胶质细胞的活化.免疫组化共标结果说明DEX通过作用于脊髓的α2A-AR发挥其镇痛效应,且α2A-AR与星胶细胞存在共标. 3.伴随痛觉敏感的形成,大鼠踝关节致炎后,致炎侧脊髓背角Toll like4receptor(TLR4)、NF-κB-p65以及致炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α表达均上调.鞘内连续3d应用DEX(2.5μg)、EGCG(30μg)可显著抑制脊髓背角TLR4、NF-κB-p65以及致炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达.荧光免疫双标发现TLR4与脊髓星形胶质细胞有共标. 4.为了进一步研究α2A-AR和TLR4的关系,应用免疫共沉淀(Co-IP)技术检测α2A-AR和TLR4是否有相互作用. 结果表明使用α2A-AR特异性的抗体与TLR4抗体免疫沉淀,可以检验到TLR4;反之,使用TLR4特异性的抗体与α2A-AR抗体免疫沉淀,也可以检验到α2A-AR.用正常的免疫球蛋白IgG作对照,则检验不出以上蛋白共沉淀.此结果显示α2A-AR和TLR4之间有相互作用. 结论： 1、单关节炎大鼠脊髓背角致炎侧TLR4表达水平上调。 2、单关节炎大鼠鞘内连续3d给予DEX使致炎侧脊髓背角TLR4表达水平下调。 3、单关节炎大鼠鞘内连续3d给予DEX抑制了致炎侧脊髓背角p-NF-κB-p65表达和活化。 4、单关节炎大鼠鞘内给予TLR4抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抑制了致炎侧脊髓背角GFAP、TLR4、p-NF-κB-p65的表达。 5、α2A-AR与TLR4两者存在相互作用关系,且与星胶均有共标。 6、DEX通过作用于脊髓α2A-AR后抑制了TLR4表达,并影响了其下游的激活,从而抑制了炎症性疼痛。