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肝实质细胞的成熟分化与功能获得依赖其独特微环境中信号分子的精确调控。血管内皮细胞及其分泌的信号分子是肝脏微环境的重要组成部分。研究表明,血管内皮细胞分泌的细胞外基质对于内皮细胞成熟分化及血管再生与重构等功能具有重要作用,但其能否调节肝实质细胞的成熟分化与功能获得尚不清楚。本研究制备并鉴定人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌的基质(EC-matrix),并探究其对于人脂肪干细胞分化的肝实质样细胞(hASC-HLCs)功能成熟的作用及机制,主要研究结果如下:1 EC-matrix的特征鉴定免疫荧光染色及扫描电镜观察证实,EC-matrix中包含纤粘连蛋白(FN),I型胶原及IV型胶原;FN呈丰富的纤维状结构,IV型胶原呈网状纤维结构,I型胶原呈较致密的点状。原子力显微镜检测基质的表面钢度显示,HUVECs培养24小时分泌的基质(EC-matrix-24h)其杨氏模量为10.21kPa,而EC-matrix-48h、EC-matrix-72h及EC-matrix-96h的杨氏模量分别为7.96kPa、5.85kPa及8.02kPa。其中EC-matrix-72h的表面钢度与正常人肝脏组织相似。2 EC-matrix促进hASC-HLCs的代谢功能成熟实时定量RT-PCR分析显示,与对照组(即培养在I型胶原包被基质上的hASC-HLCs)相比,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,药物代谢I相酶,包括CYP1A2,CYP2B6,CYP2C9,CYP2E1以及CYP3A4;II相酶,包括NAT2;和药物转运体,包括ABCC2,SLC22A5,DPP4,以及转录因子FOXA2,核受体HNF4α和PXR的表达均明显增高。免疫荧光染色显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中DPP4表达明显高于对照组。P450-Glo分析结果证实,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs CYP2C9与CYP3A4酶活性明显高于对照组。免疫蛋白印迹(WB)结果显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,FOXA2,HNF4α以及PXR的蛋白表达明显高于对照组。3敲减FN可减弱EC-matrix促进hASC-HLCs功能成熟的作用实时定量RT-PCR测定表明,EC-matrix-FN敲减组(即培养在EC-matrix-FN敲减基质上的hASC-HLCs)中,I相酶(CYP2B6,CYP2C9,CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1)和药物转运体(ABCC2和DPP4)的表达显著低于EC-matrix对照组(即培养在EC-matrix基质上的hASC-HLCs);FOXA2,HNF4α和PXR的mRNA水平表达明显下降。免疫荧光染色分析显示,EC-matrix-FN敲减组中DPP4表达显著下降。P450-Glo分析表明,EC-matrix-FN敲减组中CYP2C9和CYP3A4酶活性也低于EC-matrix对照组。WB结果显示,EC-matrix-FN敲减组中FOXA2,HNF4α及PXR的蛋白水平明显低于EC-matrix对照组。4 EC-matrix促进hASC-HLCs中整合素α5的表达实时定量RT-PCR结果显示,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中,整合素亚基α5的表达与对照组(即培养在I型胶原包被基质上的hASC-HLCs)相比明显升高,而其它整合素亚基则无明显变化。免疫荧光染色及半定量分析表明,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中整合素α5β1的表达相比对照组有明显升高。流式细胞分析表明,培养在EC-matrix上的hASC-HLCs中整合素亚基α5以及整合素α5β1的表达与对照组相比明显增高,而整合素亚基β1则无明显差异。5敲减hASC-HLCs中整合素α5的表达减弱EC-matrix对肝实质细胞代谢功能成熟的作用实时定量RT-PCR分析表明,转染整合素α5 siRNA的hASC-HLCs中,I相酶(CYP2B6,CYP2C9和CYP3A4),II相酶(NAT2)和药物转运体(ABCC2,SLC22A5和DPP4)的表达明显低于对照组(即转染Nontarget siRNA的hASC-HLCs);FOXA2,HNF4α和PXR的mRNA表达水平明显下调。免疫荧光染色及半定量分析显示,转染整合素α5siRNA的hASC-HLCs中,DPP4表达明显下调。P450-Glo分析表明,转染整合素α5 siRNA的hASC-HLCs中,CYP2C9和CYP3A4活性明显低于对照组。WB结果表明,转染整合素α5siRNA的hASC-HLCs中,FOXA2,HNF4α和PXR的蛋白水平与对照组相比也有显著下调。6整合素α5β1通过Src磷酸化介导EC-matrix促进hASC-HLCs的代谢功能成熟在EC-matrix上培养的hASC-HLCs中分别加入整合素连接酶(ILK)抑制剂Cpd22(1μM),黏着斑激酶(FAK)抑制剂PF228(1μM)和Src家族酪氨酸激酶(SFK)抑制剂PP2(5μM)作用15小时后,撤除抑制剂继续培养72小时,P450-Glo分析不同抑制剂对hASC-HLCs中CYP450酶活性的影响。结果显示,SFK抑制剂使CYP2C9与CYP3A4活性分别降低40%及75%。FAK和ILK抑制剂使CYP3A4活性降低30%和58%,但不影响CYP2C9的活性。将Src siRNA转染至培养在EC-matrix上hASC-HLCs中,研究敲减Src对hASC-HLCs中代谢功能成熟的影响。实时定量RT-PCR结果显示,敲减Src的hASC-HLCs中,CYP2C9与CYP3A4的mRNA水平与对照组(即转染Nontarget siRNA的hASC-HLCs)相比明显降低,P450-Glo分析证实,敲减Src的hASC-HLCs中,CYP2C9与CYP3A4的活性与对照组相比也有明显的下降。WB证实,敲减Src的hASC-HLCs中的FOXA2,HNF4α以及PXR的表达均明显下降。综上所述,在肝实质细胞功能成熟过程中,细胞表达的整合素α5β1能够与EC-matrix中的FN特异性相互作用,促使细胞中的Src磷酸化,进一步上调转录因子FOXA2,核受体HNF4α和PXR的表达,后者促进下游靶基因CYP2C9和CYP3A4等代谢相关基因的表达和酶活性,最终诱导肝实质细胞代谢功能的成熟。