热激转录因子HsfB1和HsfB2b在非生物胁迫中的功能及分子机制研究

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植物在生长发育期间,时刻面临着多种非生物胁迫。其中,高温胁迫是制约植物生长发育的主要非生物胁迫之一。由于其固着生长特性,当高温来临时,植物只能依靠自身长期进化产生的一系列热应激反应进行应对。植物热激转录因子(Heat shock transcription factor,Hsf)是一类重要的调节因子,通过调节热激蛋白(Heat shock protein,HSP)基因的表达,来应对高温胁迫。Hsf分为A、B、C三个家族,目前研究多集中在Hsf A家族,对B和C研究较少。有研究报道,拟南芥(Arabidopsis thaliana)热激转录因子B族成员Hsf B1受A族成员Hsf A1和Hsf A2直接或间接调控;At Hsf B1和At Hsf B2b作为负调控因子共同参与热激反应,但具体功能及分子调控机制尚不明确。本研究通过拟南芥hsf B1突变体和过表达材料,明确热激转录因子At Hsf B1在应对高温胁迫中的作用。利用酵母双杂系统筛选候选互作蛋白,并通过酵母一对一回转验证和荧光素酶互补实验进一步确定互作蛋白基因,并鉴定其在高温胁迫中的生物学功能。同时探究了At Hsf B1、At Hsf B2b在盐、干旱和ABA胁迫中的功能。最后鉴定At Hsf B1和At Hsf B2b在小麦中的同源基因,并进行初步分析,以期为小麦HSF调控机制研究提供方向。主要结果如下:(1)对实验室保存拟南芥野生型Col-0、突变体材料hsf B1、hsf B2b、hsf B1/hsf B2b和过表达材料Hsf B1-GFP(自身启动子)进行高温表型鉴定,发现在较高温度下hsf B1、hsf B2b和hsf B1/hsf B2b存活率相对较高,表明At Hsf B1和At Hsf B2b在高温条件下均负向调控拟南芥的生长发育。(2)为进一步探究At Hsf B1的生物学功能,创制拟南芥过表达材料Hsf B1-Flag-m Cherry(35S启动子),观察野生型、过表达材料Hsf B1-Flag-m Cherry、Hsf B1-GFP(自身启动子)的生长发育状况。结果发现过表达材料Hsf B1-Flag-m Cherry在苗期根较野生型更短;抽薹前期植株矮小且部分植株死亡;生殖发育时期植株矮小且花和果实较少,部分植株败育;Hsf B1-GFP表型稍弱。表明在正常条件下At Hsf B1抑制拟南芥生长发育。(3)通过酵母双杂系统初步筛选到19个At Hsf B1互作蛋白,23个At Hsf B2b互作蛋白。利用酵母mating和共转两种系统,进行一对一验证。结果表明At Hsf B1和At Hsf B2b均与RPL11(AT3G53430)互作。(4)为了进一步探究RPL11的生物学功能,鉴定了突变体材料rpl11,并对对野生型Col-0、过表达材料(Hsf B1-GFP、Hsf B1-Flag-m Cherry、Hsf B2b-GFP)、突变体材料(hsf B1、hsf B2b、hsf B1/hsf B2b、rpl11)进行高温表型鉴定,发现在较高温度下Col-0、Hsf B1-GFP、Hsf B1-Flagm Cherry、Hsf B2b-GFP几乎没有存活,hsf B1、hsf B2b、hsf B1/hsf B2b、rpl11存活率较高,表明At RPL11与At Hsf B1和At Hsf B2b协同参与拟南芥热激反应。(5)对野生型Col-0、过表达材料(Hsf B1-GFP、Hsf B1-Flag-m Cherry、Hsf B2b-GFP)、突变体材料(hsf B1、hsf B2b、hsf B1/hsf B2b、rpl11)在其他非生物胁迫(盐、干旱)以及ABA下进行表型鉴定。结果表明At Hsf B1和At RPL11在拟南芥响应ABA、盐胁迫中起负向调控作用,At Hsf B2b在干旱胁迫响应中起负向调控作用。(6)对小麦热激转录因子家族基因进行系统进化、基因结构、蛋白结构分析、染色体定位,分别鉴定到At Hsf B1和At Hsf B2b在小麦中的同源基因Traes CS5A02G237900、Traes CS5A02G314700,启动子顺式作用元件预测结果表明,小麦热激转录因子可能参与干旱胁迫和ABA响应。同时构建这两个基因的过表达转基因载体,以便创制转基因小麦过表达材料。
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