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目的先前研究表明雷帕霉素(rapamycin,RAPA)治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus patients,SLE)患者及动物模型有效。SLE患者骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是一种衰老的MSCs。本研究拟进一步证明RAPA对狼疮鼠(MRL/lpr鼠)的疗效,并观察对MRL/lpr鼠BM-MSCs衰老表型及免疫调节的影响;同时探讨雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路在SLE患者BM-MSCs衰老及免疫调节异常中的作用及其机制。方法选取12只16周龄雌性BALB/c鼠为正常组,24只16周龄雌性MRL/lpr鼠,分为2组:对照组、RAPA治疗组。每两周记录小鼠存活率、体重及考马斯亮蓝法检测24小时尿蛋白定量。12周后断颈法处死小鼠,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血血清抗双链DNA(anti-double-stranded DNA,ds-DNA)抗体水平,HE染色观察肾脏、肺病理改变。体外分离、培养三组BM-MSCs至p4代后,观察细胞形态,衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色检测细胞β-gal活性,F-actin染色观察细胞骨架结构改变,Cell Counting Kit(CCK)-8法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞周期细胞分布情况,免疫印迹法(western blotting,wb)检测细胞周期相关蛋白改变。将三组bm-mscs与纯化的cd4+t细胞间接共培养,流式细胞仪检测调节性t细胞(regulatoryt,treg)及辅助性t细胞17(thelpertype17,th17)的比例,elisa检测细胞培养基上清液中转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgf)-β,白细胞介素(interleukin,il)-10,il-17及il-6变化。wb及免疫荧光法分析三组bm-mscsmtor信号通路表达及定位的改变。其次,体外分离、培养正常人及sle患者bm-mscs,wb及免疫荧光法检测两者mtor信号通路表达及定位差异。wb检测不同浓度或时间mtor抑制剂rapa抑制s6磷酸化的水平。运用小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)干扰mtor的表达,转录多聚酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,rt-pcr)、wb及免疫荧光检测干扰效果。rapa及sirnamtor干预后观察细胞形态改变,再分别检测sa-β-gal活性、细胞骨架、增殖速率、细胞周期分布情况、细胞周期相关蛋白、treg/th17比例及细胞因子变化。最后,将1×106rapa干预的sle患者bm-mscs移植治疗8只16周龄mrl/lpr鼠12周,与sle患者bm-mscs移植组及正常bm-mscs移植组比较存活率、体重、24小时尿蛋白含量、抗ds-dna抗体滴度以及肾脏、肺病理改变。采用spss17.0统计分析软件包进行数据分析计算。结果(1)与对照组比较,rapa治疗组mrl/lpr鼠存活率提高,体重持续增加,24小时尿蛋白含量及抗ds-dna抗体水平降低,he染色显示肾脏新月体形成降低、炎症细胞浸润减少,肺气管及血管损害指数、间质炎性细胞浸润程度减轻。mrl/lpr鼠bm-mscs与正常组比较,细胞体积增大,sa-β-gal阳性细胞数增多,细胞骨架排列紊乱,mscs增殖速率减缓,g0/g1期细胞比例增多,细胞周期相关蛋白p53,p21及p27高表达。rapa治疗后可逆转mrl/lpr鼠mscs的衰老表型,但不改变细胞增殖能力。三组bm-mscs与cd4+t细胞间接共培养后,rapa治疗组可上调treg比例而下调th17比例。与对照组比较发现,治疗组mscs培养基上清液中抗炎因子tgf-β及il-10浓度增高,促炎因子il-17及il-6浓度降低。与正常组mscs比较,对照组mrl/lpr鼠mtor信号通路异常激活,而rapa治疗组可抑制mscsmtor信号通路激活。(2)与正常人bm-mscs比较,sle患者mscsmtor信号通路异常激活。RAPA及si RNA干扰m TOR表达后,SLE患者MSCs细胞体积减小,SA-β-gal阳性细胞数减少,细胞骨架排列有序,但对细胞增殖速率、G0/G1期细胞比例及细胞周期相关蛋白无显著性改变。四组MSCs与CD4+T细胞间接共培养后,RAPA及si RNA干预组Treg比例上调而Th17比例下调,培养基上清液中TGF-β及IL-10浓度增高,IL-17及IL-6浓度降低。(3)RAPA干预SLE MSCs后移植治疗MRL/lpr鼠与SLE患者MSCs移植组比较,存活率提高,体重增加,24小时尿蛋白含量及抗ds-DNA抗体水平降低,与BM-MSCs移植组无显著差异。HE染色显示肾脏、肺病变程度减轻,但疗效稍逊于正常BM-MSCs移植组。结论(1)RAPA治疗MRL/lpr鼠有效,并通过抑制mTOR信号通路逆转MRL/lpr鼠BM-MSCs的衰老表型,进而改善免疫调节能力。(2)SLE患者BM-MSCs mTOR信号通路高表达,RAPA及si-RNA通过干预mTOR信号通路抑制SLE MSCs衰老表型及改善其免疫调节能力。(3)SLE患者BM-MSCs移植治疗MRL/lpr鼠无效,RAPA干预的SLE MSCs移植治疗MRL/lpr鼠有效,但疗效稍低于BM-MSCs移植组。