【背景与目的】流行病学研究表明慢性HBV感染是肝细胞癌的重要病因。中国是肝炎大国,探索HBV感染影响肝癌发生发展的机制对预防和治疗HBV感染相关的肝癌具有重要意义。近年来研究报道miRNA的异常表达与肿瘤关系密切。课题组前期发现HBV可引起miR-181a/362/382/19a在肝癌细胞和组织中表达上调,HSPA5和HSPA2可能是其潜在靶基因。HSPA5是位于内质网的一种重要分子伴侣,在应激状态下表达升高以维持内质网稳定和保护细胞免受凋亡。HSPA2也属于HSP70家族,与HSP70的氨基酸有84%的同源性,但目前研究较少。前期研究发现HSPA5/HSPA2在肝癌中的表达明显高于癌旁组织,但在体外稳定表达HBV的Hep G2.215细胞系中其表达低于Hep G2细胞系。因此HBV上调miR-181a/362/382/19a影响肝癌发生发展的机制以及HSPA5/HSPA2在体内肝癌组织与体外细胞模型表达差异的原因和意义均有待进一步探索。我们推测HBV感染可能影响多种miRNA的表达,这些miRNA调控多个靶基因的表达,进而影响多条信号通路,共同影响肝癌的发生发展。进一步筛选出miR-181a/362/382/19a的共同靶基因PTEN进行研究。本研究在前期研究的基础上检测HBV感染对肝癌组织和癌旁组织中HSPA5/HSPA2/PTEN表达的影响,明确miR-181a/362/382/19a是否靶向结合HSPA5/HSPA2/PTEN m RNA 3’UTR,探索miR-181a/362/382/19a靶向HSPA5/HSPA2和PTEN的作用差异以及miR-181a/362/382/19a是否通过调控PTEN影响肝癌细胞生物学行为和PI3K/AKT信号通路活化,为HBV感染影响肝癌发生发展提供新的实验数据,亦为HBV感染相关肝癌的临床治疗、诊断和预后提供新思路。【方法】1.HBV感染及HBV未感染的肝癌组织和癌旁组织HSPA5、HSPA2和PTEN表达的检测免疫组织化学法检测HBV感染及HBV未感染的肝癌组织和癌旁组织中HSPA5、HSPA2和PTEN的表达。2.Mi RNA靶向靶基因的荧光素酶报告基因分析通过Target Scan网站预测miRNA与靶基因m RNA结合的3’UTR序列,制备该区域片段和相应突变片段。将野生区域片段和相应突变片段分别插入荧光素酶报告基因载体中,测序验证其序列正确后得到野生型(WT)和突变型(MUT)的荧光素酶报告基因质粒。将上述质粒分别与miRNA的mimic共转染Hep G2细胞,培养24h后检测细胞萤火虫荧光素酶强度和海肾荧光素酶强度,计算相对荧光强度并分析其差异。3.Mi R-181a/362靶向HSPA5和PTEN的作用差异分析将miR-181a/362 mimic分别转染入Hep G2细胞和将miR-181a/362 inhibitor分别转染入Hep G2.215细胞,培养48h后realtime PCR同时检测细胞内HSPA5和PTEN m RNA表达水平,western blot同时检测细胞内HSPA5和PTEN蛋白表达水平。4.Mi R-382/19a靶向HSPA2和PTEN的作用差异分析将miR-382/19a mimic分别转染入Hep G2细胞和将miR-382/19a inhibitor分别转染到Hep G2.215细胞中,培养48h后realtime PCR同时检测细胞内HSPA2和PTEN m RNA表达水平,western blot同时检测细胞内HSPA2和PTEN蛋白表达水平。5.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞增殖的影响将miR-181a/362/382/19a mimic或NC-mimic与PTEN过表达质粒或其空载共转染Hep G2细胞和将miR-181a/362/382/19a inhibitor或NC-inhibitor与PTEN的RNA干扰质粒或其空载共转染Hep G2.215细胞,培养48小时后CCK-8试剂盒检测每组细胞的增殖情况。6.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞迁移的影响将miR-181a/362/382/19a mimic或NC-mimic与PTEN过表达质粒或其空载共转染Hep G2细胞和将miR-181a/362/382/19a inhibitor或NC-inhibitor与PTEN的RNA干扰质粒或其空载共转染Hep G2.215细胞,进行划痕实验(24小时后观察每组细胞的划痕愈合程度)和transwell迁移实验(24小时后计数每组细胞的迁移数量)。7.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞侵袭的影响将miR-181a/362/382/19a mimic或NC-mimic与PTEN过表达质粒或其空载共转染Hep G2细胞和将miR-181a/362/382/19a inhibitor或NC-inhibitor与PTEN的RNA干扰质粒或其空载共转染Hep G2.215细胞,进行transwell-Matrigel实验,48小时后计数每组细胞的侵袭数量。8.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对PI3K/AKT信号通路的影响将miR-181a/362/382/19a mimic或NC-mimic与PTEN过表达质粒或其空载共转染Hep G2细胞和将miR-181a/362/382/19a inhibitor或NC-inhibitor与PTEN的RNA干扰质粒或其空载共转染Hep G2.215细胞,western blot检测细胞中PTEN、磷酸化AKT(p-AKT)和总AKT的蛋白表达情况。【结果】1.临床肝癌组织标本中HSPA5和HSPA2的表达免疫组织化学检测结果表明HSPA5和HSPA2在HBV感染的癌旁组织中的表达低于在HBV未感染的癌旁组织的表达,与实验室前期发现HSPA5和HSPA2在稳定表达HBV的Hep G2.215细胞系中表达低于肝癌细胞系Hep G2中表达的结果一致。2.HSPA5是miR-181a/362的靶基因荧光素酶报告基因分析显示miR-181a/362的mimic分别和HSPA5的荧光素酶报告基因野生型(WT)质粒共转染Hep G2细胞的相对荧光强度明显低于其分别和荧光素酶报告基因突变型(MUT)质粒共转染时的相对荧光强度,说明miR-181a-5p/362-3p可分别直接靶向结合HSPA5的3’UTR,结果提示HSPA5是miR-181a/362的靶基因。3.HSPA2是miR-382/19a的靶基因荧光素酶报告基因分析显示miR-382/19a的mimic分别和HSPA2的荧光素酶报告基因野生型(WT)质粒共转染Hep G2细胞的相对荧光强度明显低于其分别和荧光素酶报告基因突变型(MUT)质粒共转染时的相对荧光强度,说明miR-382-5p/19a-3p可分别直接靶向结合HSPA2的3’UTR,结果提示HSPA2是miR-382/19a的靶基因。4.PTEN是miR-181a/362/382/19a的共同靶基因荧光素酶报告基因分析显示miR-181a/362/382/19a的mimic分别与PTEN的荧光素酶报告基因野生型(WT)质粒共转染Hep G2细胞的相对荧光强度明显低于其分别和荧光素酶报告基因突变型(MUT)质粒共转染时的相对荧光强度,说明miR-181a/362-3p/382-5p/19a可分别直接靶向结合PTEN m RNA 3’UTR,结果提示PTEN是miR-181a/362/382/19a的靶基因。5.临床肝癌组织标本中PTEN的表达免疫组织化学检测结果表明PTEN在HBV感染的癌旁组织中表达低于HBV未感染的癌旁组织中表达,提示PTEN低表达可能在肝细胞癌变中起重要作用。6.Mi R-181a/362靶向HSPA5和PTEN的作用差异分析Realtime PCR和western blot结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362的表达后HSPA5和PTEN的m RNA水平和蛋白水平都降低,且PTEN的降低程度明显大于HSPA5的降低程度,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362的表达后HSPA5和(或)PTEN的m RNA水平和蛋白水平有增高趋势,但对HSPA5的增高程度和对PTEN的增高程度无明显差异,提示miR-181a/362可分别靶向抑制HSPA5和PTEN的表达,且其表达上调对PTEN的抑制程度大于对HSPA5的抑制程度。7.Mi R-382/19a靶向HSPA2和PTEN的作用差异分析Realtime PCR和western blot结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-382/19a的表达后HSPA2和PTEN的m RNA水平和蛋白水平均降低,且PTEN的降低程度明显大于HSPA2的降低程度,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-382/19a的表达后HSPA2和PTEN的m RNA水平和蛋白水平有增高趋势,但对HSPA2的增高程度和对PTEN的增高程度无明显差异,提示miR-382/19a可分别靶向抑制HSPA2和PTEN的表达且其表达上调对PTEN的抑制程度大于对HSPA2的抑制程度。8.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞增殖的影响CCK-8试剂盒检测结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362/382/19a或干扰PTEN表达均可以促进肝癌细胞增殖,且过表达PTEN可以拮抗上调miR-181a/362/382/19a对细胞增殖的影响,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362/382/19a或过表达PTEN均可以抑制肝癌细胞增殖,且干扰PTEN表达可以拮抗下调miR-181a/362/382/19a对细胞增殖的影响,提示miR-181a/362/382/19a可通过调控PTEN表达影响肝癌细胞增殖。9.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞迁移的影响划痕实验结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362/382/19a或干扰PTEN表达均可以促进肝癌细胞划痕愈合,且过表达PTEN可以拮抗上调miR-181a/362/382/19a对细胞划痕愈合的影响,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362/382/19a或过表达PTEN均可以抑制肝癌细胞划痕愈合,且干扰PTEN表达可以拮抗下调miR-181a/362/382/19a对细胞划痕愈合的影响。Transwell迁移实验结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362/382/19a或干扰PTEN表达均可以明显增加迁移过膜的肝癌细胞数量,且过表达PTEN可以拮抗上调miR-181a/362/382/19a对细胞迁移的影响,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362/382/19a或过表达PTEN均可以明显减少迁移过膜的肝癌细胞数量,且干扰PTEN表达可以拮抗下调miR-181a/362/382/19a对细胞迁移的影响。划痕实验和transwell迁移实验均提示miR-181a/362/382/19a可通过调控PTEN表达影响肝癌细胞迁移。10.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对肝癌细胞侵袭的影响Transwell-Matrigel实验结果显示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362/382/19a或干扰PTEN表达均可以明显增加侵袭过膜的肝癌细胞数量,且过表达PTEN可以拮抗上调miR-181a/362/382/19a对细胞侵袭的影响,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362/382/19a或过表达PTEN均可以明显减少侵袭过膜的肝癌细胞数量,且干扰PTEN表达可以拮抗下调miR-181a/362/382/19a对细胞侵袭的影响,提示miR-181a/362/382/19a可通过调控PTEN表达影响肝癌细胞侵袭。11.Mi R-181a/362/382/19a通过调控PTEN对PI3K/AKT信号通路的影响Western blot结果提示在Hep G2细胞中分别上调miR-181a/362/382/19a或干扰PTEN的表达均可以增加AKT的磷酸化,且过表达PTEN可以拮抗上调miR-181a/362/382/19a对AKT磷酸化的影响,在Hep G2.215细胞中分别下调miR-181a/362/382/19a或过表达PTEN均可以抑制AKT的磷酸化,且干扰PTEN表达可以拮抗下调miR-181a/362/382/19a对AKT磷酸化的影响,提示miR-181a/362/382/19a可通过调控PTEN促进肝癌细胞PI3K/AKT信号通路活化。【结论】研究结果提示:(1)相对于癌组织而言,在血液供应相对正常的肝癌周围组织中,HBV感染后HSPA5表达比HBV未感染时低,使其对化疗药物更敏感,更易凋亡坏死而引发肝功能紊乱;(2)HBV通过上调miR-181a/362而抑制其靶基因HSPA5表达,从而为HBV稳定复制提供有利环境,HBV上调miR-382/19a靶向抑制HSPA2的表达,HSPA2在Hep G2.215细胞系中表达下调,但其意义有待进一步研究;(3)miR-181a/362/382/19a均能与PTEN 3’UTR结合,PTEN是miR-181a/362/382/19a的共同靶基因,HBV感染可上调miR-181a/362/382/19a的表达,综合效应进而显著抑制PTEN的表达;(4)miR-181a/362对HSPA5和PTEN的靶向作用以及miR-382/19a对HSPA2和PTEN的靶向作用均存在差异,miR-181a/362/382/19a对PTEN有更显著的抑制作用;(5)miR-181a/362/382/19a高表达或干扰PTEN表达均可以促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,且过表达PTEN可以拮抗miR-181a/362/382/19a高表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,说明miR-181a/362/382/19a通过调控PTEN表达影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭;(6)miR-181a/362/382/19a可通过调控PTEN表达促进肝癌细胞PI3K/AKT信号通路活化。