体外受精及胚胎移植技术（IVF-ET）目前是治疗不孕不育最为有效的方法之一,临床上此技术的常规方法是在早期的卵裂期（Day 2-3）时即把胚胎移植到子宫内,以尽可能减少体外环境对胚胎的影响。但是目前该技术存在几方面难以解决的问题:主要有①胚胎植入率和临床妊娠率较低,②流产率相对较高,③多胎妊娠发生率较高,而胚胎囊胚期移植可能成为解决这些问题的关键技术。因此,研究小鼠胚胎2-细胞期发育至囊胚期的影响因素,对胚胎囊胚期移植技术的发展具有重要的参考价值。褪黑素为具有抗氧化作用的激素,由位于第三脑室后壁的松果体（Pineal Gland）分泌。近来研究显示褪黑素可以直接影响体外哺乳动物胚胎细胞的发育。培养液中加入1μg/ml的褪黑素可以促进动物冻融囊胚发育能力,提高囊胚孵出率,并可保护胚胎免受H2O2诱导的氧化应激伤害。对小鼠的研究显示,高浓度的褪黑素(10^-4-10^-6 M)可以增加受精率,而低浓度的(10^-6或10^-8)褪黑素可改善胚胎在体外的早期发育情况。本课题以小鼠2-细胞胚胎为实验动物,在体外观察褪黑素对胚胎发育的生物学活性的影响,并探索褪黑素对胚胎作用的具体机制,为优化体外胚胎培养系统提供理论和实验依据。本实验分为二部分:第一部分:褪黑素对小鼠2-细胞胚胎发育的影响目的:研究褪黑素对小鼠2-细胞期胚胎发育的影响。方法:将共获得的807枚2细胞期小鼠胚胎随机分为7个组,在培养液中添加不同浓度褪黑素,在不同的作用时间点,利用细胞计数的方法,显微镜下观察并记录小鼠胚胎囊胚数目、孵出数目,计算囊胚率和孵出率,研究不同浓度褪黑素对小鼠2-细胞胚胎整个体外发育过程的影响情况。结果:不同浓度褪黑素对小鼠2-细胞期胚胎存在双向作用,在10^-13-10^-5M之间促进细胞囊胚形成和孵出,在10^-9M时促进效应达到最高,而在10-3M时则呈现出一定的抑制作用。结论:褪黑素可提高体外培养鼠胚的囊胚率和孵出率,在10^-9M时体现为对胚胎最大的促进效果,高于或者低于该浓度促进作用减弱。说明褪黑素对小鼠胚胎发育的影响与体外作用浓度密切相关,最佳的浓度为10^-9M。第二部分:褪黑素对小鼠2-细胞胚胎发育作用机制研究目的:探索褪黑素对2-细胞胚胎发育作用的潜在机制,为体外IVF-ET条件优化提供理论和实验依据。方法:应用特异性荧光探针检测不同浓度褪黑素作用胚胎后,培养液中ROS和RNS水平。随后通过不同浓度褪黑素作用小鼠2-细胞胚胎后,测定小鼠2-细胞胚胎的细胞周期,利用PCR技术检测凋亡相关分子Bax,Bcl-XL等mRNA的表达情况,探索褪黑素对胚胎细胞生长的作用机制。结果:不同浓度褪黑素加入培养液后,随着褪黑素浓度的升高,RNS水平出现一定的波动性,在10^-910^-7M之间呈现最大程度的清除作用,而对ROS水平未见显著影响,说明在胚胎发育过程中产生的活性氮自由基,可被褪黑素清除,且浓度最好在10^-910^-7M。细胞周期表明,高浓度褪黑素处理2-细胞胚胎后出现较为显著的G0/G1细胞周期阻滞情况,凋亡相关分子mRNA检测表明,凋亡相关分子Bax,Bcl-XL等表达随着褪黑素浓度增加而上调。结论:褪黑素在10^-910^-7M之间可有效下调RNS的水平,减少RNS对胚胎发育的不利影响。高浓度褪黑素可引起胚胎细胞周期阻滞,凋亡相关分子表达增加。