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研究目的:本研究主要是通过利用脑部注射立体定位仪实现左侧侧脑室注射LV-mo-miR-375-3p,并建立缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemia brain damage,HIBD)模型,研究miR-375-3p对新生大鼠远期学习记忆能力及昼夜节律变化的作用,解析微小RNA(LV-rno-miR-375-3p)对哺乳动物缺氧缺血因素后远期行为学及昼夜节律的影响,为临床远期干预提供参考依据。研究方法:1、将生后24小时内的新生SD大鼠随机分为新生大鼠按照随机分配原则分为miR-control sham,miR-control HIBD,miR-375-3p sham 组和 miR-375-3p HIBD 组。利用脑部注射立体定位仪,在予以乙醚麻醉后,固定大鼠于硬板上,通过配套微量注射器进行精确性地(X=0.9mm,Y=0.4mm,Z=3.1mm)完成左侧侧脑室注射。然后待7日龄时,制作HIBD模型及假手术组,此处,我们制作了新生大鼠的HIBD模型,根据Rice-Vannucci方法,清晰分离出左侧颈总动脉,见其充血明显,搏动强烈,予以双线结扎,并在中间离断。将新生大鼠放入8%O2和92%氮气的缺氧仓中缺氧3小时,结束后返回母鼠笼内。sham组在手术过程中只是对左颈部总动脉分离,不对其进行结扎和离断。缝合皮肤后送回母鼠笼内。于第10天时,利用活体成像技术,了解病毒荧光转染状况。常规提供水、私饲料及适宜温度饲养至3周龄时(此时大鼠活动相对活跃),开始进行行为学测试。2、利用Morris水迷宫设备对大鼠进行游泳训练6天后(中间无间断),完成两部分实验:定位航行、空间探索实验,主要测试miR-control sham,miR-control HIBD,miR-375-3p sham组和miR-375-3p HIBD差别。踏轮实验中,所有大鼠均是单笼饲养,可以在笼内自由活动,各组分别于LD(12:12)的模式:08:00开灯,20:00关灯下适应一周后,改为DD(完全黑暗)连续跑轮2周。排除光照影响后,分析四组大鼠自身昼夜节律变化的差异。通过旷场实验研究测试四组大鼠的运动功能和焦虑状态。利用Y迷宫实验,测试四组大鼠在各个臂中的停留时间和穿梭次数,了解四组间的学习记忆差别。3、SD大鼠完成行为学测试后,即第14周龄时,剖开大鼠大脑外壳,观察缺氧后的大脑组织外观,及取出完整松果体(与节律相关),利用TaqMan探针技术完善RT-qPCR扩增及利用流式细胞仪分析荧光表达差异。研究结果:1、慢病毒包被的LV-rno-miR-375-3p、空病毒通过侧脑室注射10天后,经过活体成像技术,可以清晰看见正常对照同日龄SD大鼠无荧光成像,而LV-rno-miR-375-3p及空病毒组SD大鼠荧光明显。证实原位病毒注射成功。2、踏轮结果记录由软件clocklab3完成。数据分析软件由MathWorks完成。显示miR-control HIBD组大鼠与miR-375-3p HIBD组大鼠周期无统计学意义(p>0.05)。但大鼠的运动起始时间存在差异,且两者的起始时间相差半小时以上,发现两组之间存在统计学意义(P<0.05)。说明miR-375-3p对缺氧缺血后的大鼠运动周期影响不明显,但是对于大鼠的运动时相影响较大。3、大鼠通过游泳强化训练后,平均逃避潜伏时间逐渐下降。空间探索实验中,miR-375-3pHIBD与miR-control HIBD组穿越平台次数之间有统计学意义(P<0.05),同样miR-375-3pHIBD与miR-375-3psham之间也有统计学意义(P<0.05),但大鼠在通过平台所在象限统计的时间无统计学意义(P>0.05)。空间探索实验说明侧脑室注射慢病毒,过表达miR-375-3p后,出现空间学习和记忆能力的下降。4、在旷场实验中,miR-375-3p HIBD组和miR-control HIBD组在活动距离(Distance)方面,两组间在旷场中的活动距离具有统计学差异(P<0.05),miR-375-3p HIBD组较miR-control HIBD组活动距离有统计学意义(P<0.05)。两组在运动速度(Speed)的数据显示有统计学意义(P<0.05)。旷场实验说明过表达miR-375-3p后,大鼠表现出更加活跃、更易于在中央缺氧区域活动,与HIBD作用可能存在协同作用。5、Y迷宫目标臂停留时间无统计学意义(P>0.05),且两组在穿越目标臂的次数无统计学意义(P>0.05)。6、通过松果体(跟节律有关)的标本采集和制作细胞悬浮液,通过RT-qPCR及流式细胞仪技术从分子学水平进一步验证,注射LV-mo-miR-375-3p的SD大鼠基因相对表达量及荧光成像均显著高于正常对照组。说明病毒注射成功,并且感染持久能力强,也说明前期的行为学实验结果的可靠性。但实验存在不足之处,是未进行完善空病毒组的荧光检测。结论:通过过表达miR-375-3p制作HIBD模型后,我们可以发现,miR-375-3p可改变缺氧缺血性新生大鼠远期运动、学习记忆能力及运动时相的异常。前期有研究报道,HIBD可以导致新生大鼠出现学习记忆缺陷,在过表达miR-375-3p后发现,可以加重此现象,出现学习记忆功能进一步下降。在昼夜节律方面,对昼夜周期影响不明显,但可以明显改变活动起始时间。在旷场实验中,表现为活动速度、活动距离及中央区域停留时间均有改变,较其它鼠更易于焦虑。情感影响较为明显,跟临床上新生儿HIBD产生的巨大损伤有关,产生神经神经系统异常,如智力低下,脑瘫,焦虑等等症状相似。新生SD大鼠过表达miR-375-3p,在常规饲养至14周龄时,我们完善探针RT-qPCR、流式细胞技术,可以发现:体内miR-375-3p仍可以持续长久高表达。