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背景和目的:ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1),是胆固醇逆转运途径中转运胆固醇以及磷酯到高密度脂蛋白的重要蛋白,乏脂的载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,apoA-I)可以通过ABCA1获得脂质,同时apoA-I与ABCA1的相互作用构成了HDL形成的限速步骤。脂质代谢发生异常可能会导致非酒精脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatistis,NASH)的发生。根据实验室前期研究结果表明,在肝细胞HepG2细胞中,不饱和脂肪酸可以通过促进ABCA1蛋白降解从而降解ABCA1的表达,导致肝细胞中脂质堆积。因此,本研究假设如果用脂肪酸使细胞内堆积大量脂质后,再通过转染ABCA1以及apoA-I这些与脂质转运相关的重要质粒,使ABCA1过量表达,观察是否可以将细胞内已形成的脂质转运出细胞,从而减轻脂质对细胞的毒害作用。本研究旨在探索一种新途径改变细胞内脂质代谢来预防NASH的发生。
方法:
(1)经油红O染色(Oil Red O staining)以及透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检测不同实验条件下脂质在细胞内的定位情况;
(2)通过MTT法检测不同浓度及类型的脂肪酸作用细胞6、12、24小时后,细胞活性的变化情况;
(3)分别转染空载体质粒pcDNA3.0、质粒apoA-I、质粒shRNA-ABCA1、质粒ABCA1以及共同转染质粒ABCAl和apoA-I,通过Real-TimePCR检测ABCA1转录水平表达:通过Westernblot的实验方法,检测ABCA1以及apoA-I蛋白水平的表达情况;
(4)分别转染空载体质粒pcDNA3.0、质粒apoA-I、质粒shRNA-ABCA1、质粒ABCA1以及共同转染质粒ABCA1和apoA-I,通过检测甘油三酯、游离脂肪酸以及胆固醇试剂盒检测细胞内甘油三酯、游离脂肪酸含量以及胆固醇的外流。
结果:
(1)与control组细胞相比,过表达apoA-I组细胞内的甘油三酯、游离脂肪酸以及胆固醇均有显著减少;
(2)通过油红O染色、透射电镜观察,选择最适浓度的油酸作用BEL-7402细胞,同时确定最终构建NASH细胞模型的实验条件为使用250μM油酸作用BEL-7402细胞24小时;
(3)转染过量表达ABCA1以及共转染ABCAl与apoA-I,增加BEL-7402细胞内胆固醇外流,减少细胞内FFA和TG堆积;抑制ABCA1以及共转染shRNA-ABCA1与apoA-I,减少BEL-7402细胞内胆固醇外流,增加细胞内FFA和TG堆积。
结论:
(1)通过不饱和脂肪酸处理BEL-7402细胞可成功构建NASH细胞模型;
(2)过表达apoA-I可以直接影响到ABCA1蛋白表达,从而减少胆固醇、游离脂肪酸及甘油三酯在人肝细胞内的聚积;
(3)ABCA1蛋白表达的增多或减少直接导致BEL-7402细胞中脂质堆积的变化。