多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌疾病之一,患病率4%～12%。PCOS起病自青春期始,生育期以排卵异常、高雄激素血症、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)为特征,表现为月经不规律、闭经、不育,伴或不伴肥胖、多毛,远期并发症有糖尿病、高血压、血脂异常、冠心病、动脉硬化、子宫内膜癌、乳腺癌等。IR在PCOS发病和发展中起着重要作用,不仅使PCOS患者出现糖脂代谢紊乱,还对生殖系统本身产生重大影.响,促使卵巢发生形态学改变和激素分泌异常、卵泡成熟障碍,导致月经紊乱、排卵障碍等临床症状。脂肪组织是人体最大的内分泌器官。脂肪细胞是脂肪组织的功能实体,产生许多细胞因子。这些脂肪因子具有激素样作用,既跟随血循环对远处部位起作用,也可以通过自分泌、旁分泌的形式对局部起作用,同时脂肪细胞本身又是许多激素的靶细胞。脂肪因子中既有瘦素等损害生殖能力的“有害”脂肪因子,也有脂联素等增加胰岛素敏感性的“有益”脂肪因子。网膜素(omentin)是近年来发现的“有益”脂肪因子之一。omentin在PCOS患者中水平如何,与肥胖、IR有没有关系,目前研究较少,没有明确结论。omentin对卵巢本身有没有影响,机制如何,怎样进行干预,目前还没有相关研究。因此本课题拟对PCOS的临床特征与omentin及IR的相关性,以及建立PCOS动物模型,使用GLP-1类似物利拉鲁肽干预进行研究,探讨omentin对卵巢的影响和可能机制及药物干预效果。第一部分 多囊卵巢综合征血清网膜素及超声特征与胰岛素抵抗的相关性研究目的:1、比较不同IR状态下PCOS患者内分泌指标与卵巢超声特征的差异和相关性。2、探索血清omentin与IR及性激素水平、BMI的相关性。方法:1、收集广西医科大学第一附属医院就诊的PCOS患者195例,选同期健康体检者50例为对照,测量身高、体重,测定空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等内分泌指标,行卵巢超声测量卵巢体积、最大卵泡直径等指标。2、应用酶联免疫法测定血清omentin水平。将PCOS患者分别分为IR亚组、非IR亚组和超重/肥胖亚组、体重正常亚组进行分析。结果:1、PCOS组的BMI、血清FINS、稳态模型指数(HOMA-IR)、血清T、LH、LH/FSH均显著高于对照组(p<0.05),卵巢超声显示卵巢体积较对照组显著增大[(12.18±3.89)ml vs(7.85±3.07)ml](p<0.05),卵泡最大直径较对照组显著缩小[(6.42± 1.58)mm vs(9.16±1.78)mm](p<0.05);PCOS-IR组的BMI及T较PCOS-NIR组显著增高(p<0.05),平均卵巢体积较PCOS-NIR组显著增大[(12.76±3.78)ml vs(11.43±4.01)ml](p<0.05),卵泡直径较PCOS-NIR组显著缩小[(5.08±1.63)mm vs(7.05±1.72)mm](p<0.05);相关性分析提示PCOS患者卵巢平均体积与BMI、HOMA-IR及T、LH/FSH呈正相关,卵泡直径与HOMA-IR、BMI、T负相关。2、PCOS患者血清omentin较对照组显著降低[(90.15±46.66)pg/mlvs(115.29±33.92)pg/ml,p<0.05],PCOS-IR组omentin较PCOS-NIR组显著降低[(69.14±36.90)pg/ml vs(109.13±42.42)pg/ml,p<0.05],PCOS超重/肥胖组0mentin较PCOS体重正常组显著降低[(42.85±19.39)pg/ml vs(111.12±34.50)pg/ml,p<0.05]。Omentin 与 BMI、HOMA-IR 负相关(p<0.01)。多元逐步回归显示仅BMI进入回归方程。结论:1、IR对卵巢形态有显著的影响。PCOS合并IR患者卵巢体积明显增大,卵泡直径较小。卵巢体积与IR、高雄激素血症、肥胖呈正相关,卵泡直径与IR、高雄激素血症呈负相关。2、本研究首次发现在广西地区非肥胖人群为主的PCOS患者中,血清omentin明显降低,合并IR或超重/肥胖会使血清omentin水平进一步下降。血清omentin与BMI及IR呈负相关。多元回归显示仅BMI可以解释血清omentin的变化。Omentin可能通过影响肥胖和IR参与PCOS发病。3、PCOS患者卵巢多囊性变化及高雄激素改变与omentin没有直接关系,但omentin可以通过对肥胖和IR的影响间接促进卵巢形态学变化和高雄激素血症。第二部分多囊卵巢综合征大鼠网膜素的表达及利拉鲁肽对其干预的研究目的利用来曲唑建立PCOS大鼠模型,通过药物干预及免疫学、分子生物学手段研究GLP-1类似物利拉鲁肽对PCOS大鼠糖代谢及血清、卵巢omentin的影响,并从分子水平探讨其机制。方法1.取6周龄Wistar大鼠54只,随机分为PCOS组44只,正常对照组10只,PCOS组每日给予来曲唑(1mg/Kg/d溶于1%羧甲基纤维素中)灌胃,对照组每日给予等体积1%羧甲基纤维素灌胃,每日以阴道涂片观察大鼠动情周期变化,每3天称重。21天后行葡萄糖耐量检查,并取血清检测性激素变化。PCOS组随机取4只大鼠,对照组取2只大鼠处死,取卵巢观察形态及组织学变化。根据大鼠动情周期改变、性激素变化、卵巢病理变化判断PCOS模型是否成功。2.建模成功后取PCOS大鼠40只,随机分为5组,每组8只,分别为PCOS对照组(不做处理)、利拉鲁肽组(利拉鲁肽400Hμg/Kg皮下注射)、二甲双胍组(二甲双胍300mg/Kg灌胃),LY组(利拉鲁肽400μg/Kg皮下注射+LY294002400 300μg/Kg腹腔注射)、沙格列汀组(沙格列汀10mg/Kg灌胃)。另取正常雌性大鼠8只为正常对照组(不做处理)。3.干预3周后取血测FPG、FINS、T,ELISA法检测血清omentin 水平,免疫组化法测卵巢磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)85α、丝/苏氨酸激酶(AKT)表达,荧光定量PCR法检测卵巢omentin表达。结果1.来曲唑灌胃21天后,PCOS组大鼠全部失去动情周期,体重较对照组增加(p<0.05),卵巢组织切片HE染色可见沿包膜下排列的多个囊性扩张的卵泡,卵泡内卵母细胞消失,颗粒细胞层减少,卵泡膜细胞层增厚。对照组仍保持规律的动情周期,组织学检查见颗粒细胞多层,卵泡内可见卵母细胞及放射冠。PCOS组大鼠血清LH、FSH、T均较对照组显著升高(p<0.05),OGTT60min、120min 血糖及 Omin、30min 胰岛素均较对照组显著升高(p<0.05)。PCOS组血清omentin显著低于对照组(p<0.05)。2.经药物干预3周后,利拉鲁肽组体重、血FINS、T及HOMA-IR均较PCOS对照显著下降,干预后omentin上升(p<0.05)。与正常对照组比较,利拉鲁肽组血FPG、FINS、HOMA-IR、干预后omentin无明显差异(p>0.05),T仍有显著升高(p<0.05)。利拉鲁肽组与二甲双胍组比较以上各指标及LH、FSH、T均无显著差异(p>0.05)。利拉鲁肽组与LY组比较,体重、血FPG、FINS、HOMA-IR均显著下降,血清omentin明显升高(p<0.05),血清LH、FSH、T均无显著差异(p>0.05)。利拉鲁肽组与沙格列汀组比较,FINS显著下降(p<0.05),余各指标均无明显差异(p>0.05)。3.免疫组化结果显示,利拉鲁肽组卵巢PI3K85α、AKT蛋白表达均显著高于PCOS对照组(p<0.05)和LY组(p<0.05),接近正常对照组(p>0.05),与二甲双胍组比较无明显差异(p>0.05),与沙格列汀组比较PI3K85α蛋白表达显著升高(p<0.05),AKT蛋白表达无差异(p>0.05)。4.荧光定量PCR结果显示,利拉鲁肽组卵巢omentin mRNA表达较PCOS对照组和LY组相比升高,但差异未达到统计学意义(p>0.05);与二甲双胍组、沙格列汀组、正常对照组比较也有升高趋势,但无统计学意义(p>0.05)。结论1.来曲唑法大鼠模型的性激素改变、卵巢病理特征均与PCOS特征接近,且可以表现出体重增加、糖代谢改变及高胰岛素血症,表现稳定,是良好的PCOS造模法,可以用于药物干预PCOS的研究。2.本研究首次发现GLP-1类似物利拉鲁肽可以改善PCOS大鼠IR状态,增加血清omentin浓度,降低血清T浓度,与常用的胰岛素增敏剂二甲双胍效果类似。3.卵巢中有omentin的mRNA表达,利拉鲁肽可以增加卵巢中omentin mRNA表达和PI3K85α、AKT蛋白表达,与二甲双胍效果接近。这一作用可以被PI3K抑制剂LY294002阻断。这尚属国内外首次发现卵巢中omentin表达可以被利拉鲁肽和二甲双胍等降糖药物所改变。4.利拉鲁肽可能是通过PI3K/AKT途径改善PCOS大鼠卵巢局部IR,并增加omentin的表达。本课题首次对利拉鲁肽干预PCOS的机制进行研究,并发现利拉鲁肽不仅能通过减轻体重治疗PCOS,还可以调节卵巢PI3K/AKT途径,进而影响omentin表达和卵巢功能,为治疗PCOS提供了基础理论依据,具有独创性。