近年来,随着药物分析技术及中药现代化研究的发展,研究中西药制剂的相互作用已逐渐成为人们关注的热点。氯吡格雷是迄今上市最早、应用最广的口服抗血小板药物。但在临床应用中常出现氯吡格雷抵抗现象,约5%⁴0%患者在长期服用该药物后抗血小板聚集药效反应较差,治疗中会有心血管事件反复发生,需与其他抗血小板药物联合应用。丹参胶囊是临床上常用的活血化瘀的中成药物,具有抗血小板聚集、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量等药理作用,主要用于治疗心绞痛、冠心病等疾病,也已成为各种心脏疾病药物治疗系列中最为重视的药物之一。临床上常有将氯吡格雷和丹参胶囊联合使用的经验。丹参胶囊对氯吡格雷的作用带来的临床效应可能会表现在两个方面:一方面,因两药合用表现出较强的抗血小板聚集作用,增加潜在的出血风险;另一方面,因两药合用部分患者因氯吡格雷抵抗而致抗血小板作用减弱,易导致再次血栓风险。只有弄清楚丹参胶囊及其活性成分对氯吡格雷药动学及抗血小板聚集的作用的影响及其作用机制,才能避免出血或再次血栓的风险。氯吡格雷是一种无活性的药物前体,进入体循环后,药物经过肝脏细胞色素P450酶代谢生成活性代谢产物。有文献报道,其他经肝细胞色素P450酶代谢的药物可干扰氯吡格雷的代谢;而丹参胶囊对介导氯吡格雷代谢的酶系的影响尚未见报道。由此可见,研究丹参胶囊对CYP450酶系的作用是诱导还是抑制,有助于评价两药合用的安全性。本研究拟招募健康志愿者20名,通过荧光染色原位杂交方法,测定基因类型,然后比较单剂量口服氯吡格雷和丹参胶囊与氯吡格雷联合应用后,氯吡格雷的药效学及药动学的变化,来阐明丹参胶囊对人体内氯吡格雷药效学及药动学的影响。利用血小板聚集实验测定氯吡格雷的药效学;利用LC-MS/MS技术,测定氯吡格雷及其活性代谢产物的浓度来研究药动学;在体外采用肝微粒体温孵试验方法和Western-blot法测定丹参胶囊的主要活性成分隐丹参酮及丹参酮ⅡA对CYP3A4酶活性的影响及对其蛋白水平表达的影响,在分子水平从CYP450酶活性的角度阐明丹参胶囊对氯吡格雷药效学和药动学的影响。最大限度地减少因药物相互作用而导致的不良事件,为临床上两药的联合应用提供理论依据。第一部分丹参胶囊定性定量分析方法的建立（一）LC-MS/MS测定丹参胶囊中隐丹参酮及丹参酮ⅡA的含量目的:本研究基于HPLC-MS/MS技术,分别建立丹参胶囊中指标成分隐丹参酮及丹参酮ⅡA的定性及定量方法,为丹参胶囊的研究提供可靠的方法。方法:采用Symmetry C18色谱柱（150 mm×4.6 mm i.d.,5μm）,流动相A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱。采用电喷雾离子源（ESI）,以正离子模式进行检测。检测方式为多反应监测（MRM）。用于定量分析的离子对分别为m/z 297.1→251.2（隐丹参酮）、m/z 295.1→277.1（丹参酮ⅡA）。结果:丹参胶囊中隐丹参酮及丹参酮ⅡA分别在0.6256²0.02 ng/mL、0.6325²0.24ng/mL浓度范围内线性关系良好,定量限分别为0.620 ng/mL,0.630 ng/mL;方法精密度（RSD）分别为2.1%和1.8%,隐丹参酮及丹参酮ⅡA的回收率均大于96.2%。结论:本研究建立了针对丹参胶囊中隐丹参酮及丹参酮ⅡA的HPLC-MS/MS测定方法,该法高选择性、高灵敏度,可用于丹参胶囊活性成分的快速测定。（二）LC-MS/MS法测定人血浆中隐丹参酮及丹参酮ⅡA的含量目的:采用LC-MS/MS法测定人血浆中隐丹参酮及丹参酮ⅡA的浓度。方法:血浆样品经甲醇沉淀蛋白后,以乙腈-水（含0.1%甲酸）为流动相,梯度洗脱,采用Symmetry C18（150 mm×4.6 mm i.d.,5μm）色谱柱进行分离,质谱采用电喷雾离子源（ESI）,正离子模式,检测方式多反应监测。用于定量分析的离子对分别为m/z 297.1→251.2（隐丹参酮）、m/z 295.1→277.1（丹参酮ⅡA）、m/z 360.9-233.0（内标,非诺贝特）。结果:人血浆中隐丹参酮及丹参酮ⅡA分别在0.5005¹00.1ng/m L、0.5060¹01.2 ng/mL的浓度范围内线性关系良好,定量限分别为0.5005ng/mL和0.5050 ng/mL,日内、日间精密度（RSD）均小于8.3%,低、中、高3种浓度隐丹参酮及丹参酮ⅡA的方法平均回收率均大于88.3%。结论:本研究所建立的分析方法特异性好、灵敏度高、精密度好、简便快速,可用于人血浆中隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量测定。第二部分受试者的选择和氯吡格雷及其活性代谢产物的LC-MS/MS分析方法建立（一）健康受试者的选择及其基因型检测目的:公开招募健康受试者,并对其进行基因检测,确定所招募受试者的基因型与代谢型,筛选出20名健康受试者。方法:撰写试验方案,经河北医科大学第二医院医学伦理委员会批准,在网站上发布招募广告,公开招募健康受试者。采用测序反应通用试剂盒对受试者进行基因检测。结果:所招募健康受试者的年龄均在25³0岁范围内,BMI在19²5kg/m²范围内,最终筛选出20名健康受试者,均为快代谢型或者中间代谢型。结论:本研究筛选出快代谢型和中间代谢型的志愿者共计20名,以此研究丹参胶囊对该类基因型受试者氯吡格雷的药代动力学和药效学的影响。（二）人血浆中氯吡格雷及其活性代谢物的LC-MS/MS分析方法的建立目的:建立一种测定人血浆中氯吡格雷及其活性代谢产物浓度的HPLC-MS/MS检测方法。方法:以2-溴-3’-甲氧基苯乙酮（MPB）作为衍生化试剂,以噻氯匹定为内标,使用Diamonsil C18色谱柱,流动相为乙腈:1 mmol/L乙酸铵水溶液（0.01%甲酸）（80:20）,流速:1.0 mL/min。使用电喷雾离子源（ESI）,采用正离子模式、多反应监测（MRM）进行扫描分析。监测离子对为m/z322.2→m/z 212.0（氯吡格雷）、m/z 504.4→m/z 354.1（活性代谢物）和m/z264.2→m/z 154.1（噻氯匹定）。结果:人血浆中氯吡格雷及其活性代谢产物分别在0.093²3.3 ng/mL和0.32⁸0.0 ng/mL浓度范围内良好,定量限分别为0.093 ng/mL和0.320ng/mL,日内、日间精密度（RSD）均小于7.0%,低、中、高3种浓度氯吡格雷及其活性代谢产物的方法平均回收率均大于81.9%。结论:该方法操作灵敏度高,特异性强,重复性好,简便快速。可用于人血浆中氯吡格雷及其活性代谢产物浓度的测定。第三部分丹参胶囊对人体内氯吡格雷药动学特征的影响目的:从药动学角度阐述丹参胶囊对氯吡格雷产生的作用。方法:20名受试者单次口服氯吡格雷负荷剂量300 mg,7天后,于第8天口服丹参胶囊4粒,每天3次,连服6天。在第14天口服4粒丹参胶囊,然后口服氯吡格雷300 mg,于氯吡格雷服药前和服药后的不同时间采集血样,采用HPLC-MS/MS方法测定人血浆中氯吡格雷及其活性代谢物的浓度。采用DAS统计软件,对药时曲线的数据进行拟合,按非室模型计算相关药代动力学参数。结果:服用丹参胶囊后,氯吡格雷及其活性代谢产物的表观清除率增加了96.5%和73.7%,相应的C_max下降了41.7%和32.9%,与此同时,AUC_（0,∞）分别下降了49.3%和41.5%。结论:丹参胶囊显著改变了氯吡格雷及其活性代谢产物的药动学参数,包括CL/F、Cmax和AUC_（0,∞）,即丹参胶囊促进了氯吡格雷的代谢。第四部分丹参胶囊对人体内氯吡格雷抗血小板聚集作用的影响目的:研究丹参胶囊在健康志愿者体内对氯吡格雷抗血小板聚集的作用。方法:20名受试者单次口服氯吡格雷负荷剂量300 mg,7天后,于第8天口服丹参胶囊4粒,每天3次,连服6天。在第14天口服4粒丹参胶囊,然后口服氯吡格雷300 mg,于氯吡格雷服药前和服药后的不同时间采集血样,利用血小板聚集功能检测试剂盒（光学比浊法）测定血小板聚集率。结果:与单用氯吡格雷比较,合用丹参胶囊后,血小板聚集抑制率明显降低,即血小板聚集率增加。结论:通过对比实验结果,与单用氯吡格雷比较,合用丹参胶囊后,丹参胶囊使氯吡格雷的抗血小板聚集作用减弱。第五部分丹参胶囊中隐丹参酮及丹参酮ⅡA对人肝脏细胞CYP3A4活性的影响目的:研究丹参胶囊中隐丹参酮及丹参酮ⅡA对人肝细胞色素P450酶中CYP3A4活性及蛋白表达的影响,明确这两种成分对CYP450酶的作用,从分子基础阐明隐丹参酮及丹参酮ⅡA对氯吡格雷代谢的影响,为临床合理联合使用丹参胶囊与氯吡格雷提供理论依据。方法:利用肝微粒体温孵试验方法考察隐丹参酮及丹参酮ⅡA对人肝细胞色素P450酶中CYP3A4活性的影响;通过蛋白印迹法法考察隐丹参酮及丹参酮ⅡA在给药后48 h对人肝细胞中CYP3A4蛋白表达的影响。结果:与空白对照组比较,肝微粒体温孵后,隐丹参酮及丹参酮ⅡA两种成分能增强CYP3A4的酶活性,且在20 min时结果有统计学意义（P<0.05）。隐丹参酮及丹参酮ⅡA干预人肝脏细胞48 h后,隐丹参酮及丹参酮ⅡA能诱导肝脏细胞CYP3A4蛋白的表达。结论:体外实验证明,丹参胶囊中两种活性成分能增强CYP3A4酶的活性、诱导肝脏细胞CYP3A4的蛋白表达,可能是丹参胶囊诱导氯吡格雷代谢的根本原因。