细胞多能性调控机制的起源与进化是干细胞生物学研究的基本问题。大量研究证实，转录因子Oct4(octamer-binding transcription factor-4)（又称为Pou5f1）是哺乳类胚胎内细胞团及体外培养胚胎干细胞（embryonic stem cells。ESCs）多能性维持的关键因子，同时在原始生殖细胞（PGC）的存活及精原细胞、卵细胞的发育过程中具有重要作用。如Oct4缺失小鼠胚胎发育至囊胚期，胚胎内无内细胞团的形成，只存在大量的滋养层细胞，并于着床前死亡；条件性敲除Oct4导致原始生殖细胞（PGC）的凋亡；Oct4与Sox2、Klf4和cMyc共转染已分化细胞，可使其重编程，转化成多能性干细胞，即诱导性多能性干细胞（iPS），从而证实 Oct4在哺乳类细胞多能性的维持及诱导中具有不可或缺的地位与作用。哺乳类Oct4同源物是否存在于鱼类，如是，其是否具有哺乳类类似的多能性表达及其活性，值得研究。　　已有研究显示，斑马鱼、青鳉均存在哺乳类Oct4直系同源物，分别被称为pou2及oct4。有趣的是，斑马鱼Pou2、青鳉Oct4的表达模式及生物学活性与哺乳类均存在一定差异。比如，与哺乳类 Oct4不同，斑马鱼 Pou2表达于早期胚胎发育时期的神经板及脑组织，不表达于PGC，并且pou2缺失胚胎具有内细胞团，并可发育至原肠期，将其转染Oct4缺失的小鼠ESCs不能使其恢复干性，而青鳉Oct4除表达于脑组织与哺乳类不同外，其余均与哺乳类相似。斑马鱼Pou2、青鳉Oct4的表达模式及活性差异在鱼类是特例还是普遍存在，目前尚不清楚。罗非鱼隶属于鲈形目(Perciformes)鲡鱼科(Cichlidae)，是世界范围内水产养殖的重要经济鱼类，然而，迄今尚未见其多能性因子Oct4的相关报道。鉴于此，本研究主要通过免疫组化、基因敲降、细胞培养、启动子活性分析等方法，对罗非鱼（在本研究中，如未特殊说明，研究用的罗非鱼均指尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）Oct4的表达模式、多能性活性及转录调控进行了初步研究，具体如下：　　1 Oct4表达模式及多能性活性　　1.1 mRNA水平表达模式　　RT-PCR检测6月龄罗非鱼不同组织及胚胎发育不同时期oct4的表达，结果显示，oct4在卵巢中高表达，在精巢中低表达，在其他组织中未见表达，同时在胚胎发育的早期阶段，即从受精后的6 h至36 h均有表达，48 h和52 h其表达量降低，72 h后几乎检测不到表达。　　1.2蛋白水平表达模式　　免疫组化结果显示，Oct4表达于胚胎发育的不同时期，并呈现动态变化模式，即在受精后第0.5 h（1细胞期）和8 h（囊胚期）均检测到Oct4的表达，第18 h（原肠期）、45 h（体节分化期）几乎未见表达，第50 h在脑组织部位检测到表达，第52 h其表达区域其强度变大，第60 h达到最大，第72 h未见表达；在出膜后5 d的雌鱼、雄鱼性腺组织的原始生殖细胞（PGCs）、成鱼卵巢各时相的卵细胞及精巢的精原细胞均可检测到Oct4的表达。　　1.3多能性活性　　通过显微注射抑制罗非鱼 oct4 mRNA翻译的Mooct（oct4 mRNA antisense morpholino，）及5个碱基突变的Momoct（5-base mismatch morpholino），以检测罗非鱼Oct4在胚胎发育及胚胎干细胞多能性维持中的作用，结果显示，注射Mooct的胚胎发育迟缓，85％左右不能发育至原肠期便死亡，而对照组90%以上胚胎成活，并能正常发育；取注射了Mooct与Momoct囊胚期的细胞进行体外培养，结果显示，Mooct注射组不能形成胚胎干细胞样细胞，并于第2-3天内死亡，而Momoct注射组在分离后24 h即可见细胞贴壁生长，第2-3天细胞继续增殖，并呈胚胎干细胞样形态。上述结果表明，罗非鱼Oct4对于其早期胚胎发育及胚胎干细胞的多能性维持具有重要作用。　　2罗非鱼Oct4的转录调控　　2.1 Oct4启动子区序列　　从罗非鱼基因组成功分离克隆了oct4翻译起始位点上游3084 bp的启动子区序列，并构建其绿色荧光报告载体pT2AL-Oroct4-EGFP及不同长度的启动子荧光素酶表达载体，分别命名为 pOr-3056luc-reporter、pOr-1306luc-reporter、pOr-726luc-reporter和pOr-219luc-reporter。　　2.2启动子活性检测　　用pT2AL-Oroct4-EGFP显微注射罗非鱼、青鳉受精卵，结果显示，在囊胚期胚胎均观察到明显绿色荧光；用pT2AL-Oroct4-EGFP分别转染罗非鱼胚胎干细胞（TES3）、青鳉胚胎干细胞（MES1）和南方鲶的卵巢颗粒细胞（SCO1），结果显示，在TES3和MES1胚胎干细胞中均能观察到明显的绿色荧光信号，而在分化细胞SCO1未观察到信号。从而表明，oct4翻译起始位点上游3084 bp的启动子区序列在体内外均具有启动子活性，并且与细胞多能性状态密切相关，提示其可用于细胞多能性的监测。　　2.3不同长度oct4启动子区荧光素酶表达载体的活性检测　　用 pOr-3056luc-reporter、 pOr-1306luc-reporter、 pOr-726luc-reporter和pOr-219luc-reporter转染MES1细胞，通过检测荧光强度定量检测启动子区的活性大小，结果显示。pOr-726luc-reporter活性最强，其次为pOr-1306luc-reporter，表明在启动子区序列726-219 bp之间存在正向调控元件，而3056-1306及1306-726 bp之间存在负向调控元件。　　2.2 Sox2和Oct4的正向调控　　用罗非鱼 sox2和 oct4的真核表达载体 pcDNA3.1-sox2与 pcDNA3.1-oct4与pOr-1306luc-reporter共转染MES1，结果显示，Sox2与Oct4可明显增强荧光素酶活性的大小，并且呈浓度依赖，表明Sox2和Oct4可正向调控Oct4的表达。　　2.3 RA的负向调控　　分别用10 nM、100 nM RA（视黄酸，具有促进细胞分化的作用）处理MES1细胞5 d后，pOr-1306luc-reporter转染细胞，结果显示，与对照组相比，RA诱导细胞其荧光素酶活性明显降低，其中100 nM RA诱导细胞其荧光素酶活性最低。从而表明，RA可负向调控Oct4的表达。　　该研究一方面阐明了罗非鱼Oct4与青鳉具有相似的表达模式，并且在早期胚胎发育及胚胎干细胞多能性维持方面具有重要作用，从而提示Oct4的多能性表达及其活性可能广泛存在于鱼类；另一方面，明确了罗非鱼 oct4翻译起始位点上游3084 bp的启动子区序列在体内外均具有启动子活性，受到Sox2及自身的正向调控及RA的负向调控，为鱼类干细胞多能性的分子调控机制研究奠定了基础，同时也可为细胞多能性监测提供有效工具。