背景:动脉粥样硬化(AS)是威胁人类健康的重要疾病,与其相关的心脑血管疾病在发达国家和我国占死亡率第一位。AS血管病变斑块的产生和进展是由于血管壁细胞吞噬胆固醇脂并导致其在细胞内的堆积所致,在该过程中低密度脂蛋白受体家族(low-density lipoproteinreceptor superfamily,LDLRs)中的多种受体发挥了重要作用,其中(LDL receptor-related protein-1,LRP1)尤其受到重视。早期的研究发现LRP1内吞是胆固醇脂进入细胞的重要途径,且不受细胞内脂质浓度的调节,因此LRP1一直被认为是动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的重要因素之一,其本身可能起促进动脉粥样硬化进展的作用。但是近来的研究发现,巨噬细胞LRP1功能缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变反而更加严重,推测LRP1在动脉粥样硬化病程中可能有保护作用,而这和早期少量样本研究中发现的冠心病患者单核细胞可能高表达LRP1相矛盾,目前资料还难以清楚解释这种现象。新近在对肿瘤患者的研究中发现DNA甲基化可能参与LRP1基因表达调节的线索,但是其在动脉粥样硬化的发病机制中的作用目前尚不清楚,本课题就此展开研究。目的:通过较大样本观察正常人和冠心病患者单核细胞LRP1的表达情况,并在不同年龄段进行亚组分析,着重观察分析不同年龄段冠心病患者和正常人LRP1表达的差异;研究正常人和冠心病患者单核细胞LRP1基因启动子区域附近基因甲基化情况,分析其是否影响LRP1的基因表达。在体外培养的单核细胞和人血管平滑肌细胞中,给予DNA甲基化抑制剂5—脱氧杂氮胞苷改变其DNA甲基化状态,观察其是否影响LRP1的表达,并进一步观察DNA甲基化状态不同是否影响细胞的生物学行为特征。方法:采用横断面研究方法,分别收集110位不同年龄段正常体检志愿者、112例冠心病患者外周血单核细胞,采用RT-PCR方法检测LRP1的mRNA的表达情况,采用蛋白印迹法测定LRP1蛋白浓度;并从外周血白细胞中提取基因组DNA,采用亚硫酸氢钠测序方法检测LRP1基因启动子区域甲基化水平,并对结果进行统计学分析,比较不同组间是否存在差异,以及年龄和基因甲基化水平、LRP1的表达情况是否存在相关。体外培养单核细胞和血管平滑肌细胞,给予DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷,并分别给予不同细胞因子刺激干预后收集细胞测定LRP1蛋白表达,RT-PCR检测LRP1的表达情况,采用台盼兰染色活细胞计数、四唑盐(MTT)比色法观察细胞的增殖,刮伤实验模型法检测细胞的迁移并对检测结果进行统计学分析。结果:在年龄＜50岁的冠心病患者中,LRP1的mRNA表达和蛋白质表达处于较高水平,其基因的甲基化状态和同年龄段正常人相比无显著差异;年龄＞50岁的冠心病患者和正常同龄对照组相比,LRP1的表达差异消失,其mRNA和蛋白表达均处于相同水平,该年龄段正常人和冠心病患者的LRP1基因的DNA甲基化水平均有升高,而冠心病患者的LRP1基因启动子区域附近的DNA甲基化水平升高更加明显,有统计学差异(P＜0.05)。体外培养的细胞学研究中发现:5—脱氧杂氮胞苷干预会影响单核细胞和血管平滑肌细胞LRP1的mRNA和蛋白表达,干预后其表达水平升高;5—脱氧杂氮胞苷干预的血管平滑肌细胞生物学行为特性改变,其血小板源性生长因子诱导的细胞增殖、迁移受到抑制。结论:1.LRP1在早发冠心病患者(年龄＜50岁)中高表达,但是在50岁以上年龄患者中这种差异消失。这种改变可能导致了LRP1在冠心病的不同阶段发挥不同作用,由早期的代偿性保护作用转变为促动脉粥样硬化进展的作用。50岁以上冠心病患者LRP1的基因启动子附近区域的DNA甲基化状态升高可能是导致LRP1表达降低的机制之一。2.单核细胞和血管平滑肌细胞LRP1基因的DNA甲基化水平降低,会导致基因的高表达。基因的DNA甲基化水平下降,对其他外源性基因调控机制可能存在允许或增强机制。3.血管平滑肌细胞LRP1基因的DNA甲基化水平降低,能对抗PDGF诱导的平滑肌细胞的增殖和迁移作用。第一部分冠心病患者外周血单核细胞LRP1基因DNA甲基化水平的变化和意义背景:诸多研究发现,LRP1在动脉粥样硬化的发病和病情进展中发挥重要作用,但最近的系列研究结果和较早期文献报道不完全一致,推测其可能具有双重作用,因此值得深入研究其表达调控机制。LRP1的调控机制很复杂,目前还了解甚少,肿瘤学中的初步研究发现DNA甲基化可能影响了LRP1基因的表达调节,但是在冠心病发病机制中的作用还不清楚。目的:观察在正常人和冠心病患者中,LRP1的基因启动子区域是否存在DNA甲基化水平改变,这种改变是否伴随有基因表达水平的改变。方法:采用横断面研究方法,分别收集110位不同年龄段正常体检志愿者、112例冠心病患者外周血单核细胞,采用RT-PCR方法检测LRP1的mRNA的表达情况,采用蛋白印迹法测定LRP1蛋白浓度;并从外周血白细胞中提取基因组DNA,采用亚硫酸氢钠处理后测序方法检测LRP1基因启动子区域甲基化水平,并对结果进行统计学分析,比较不同组间是否存在差异,以及年龄和基因甲基化水平、LRP1的表达是否存在相关。结果:1.在20-49岁的年龄段CHD患者中,其外周血单核细胞LRP1的mRNA和蛋白质表达水平与正常对照组相比有明显升高,且存在显著差异(P＜0.05);在50—69岁年龄段中,LRP1的表达差异呈现相反趋势,在CHD患者中有降低,但是mRNA没有达到统计学差异,而蛋白质表达存在明显差异。2.20—49岁的CHD患者和正常对照组相比,其LRP1基因启动子甲基化水平均处于相对较低状态,两组之间无统计学差异(P＞0.05);年龄大于50岁的CHD患者和正常人中,其LRP1基因启动子甲基化水平均呈升高趋势,而且CHD患者组显著高于正常对照组,具有统计学差异(P＜0.05)。结论:1.LRP1在早发冠心病患者(年龄＜50岁)中高表达,但是在50岁以上年龄患者中这种差异消失。此种改变可能导致了LRP1在不同年龄冠心病发病阶段发挥不同作用,由早期的代偿性保护作用转变为促动脉粥样硬化进展的作用。2.在年龄＞50岁的患者中,LRP1的基因启动子附近区域的DNA甲基化状态升高,这可能是导致LRP1表达水平改变的机制之一。第二部分DNA甲基化状态修饰和转化生长因子对单核细胞表达LRP1的影响背景:低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)在体内多种细胞包括单核细胞表面都有表达。有多种因素能够调节LRP1的表达水平,最近有在体研究发现DNA甲基化可能影响上皮细胞LRP1的表达水平,但是目前尚未有在体外培养的单核细胞中作用的研究。目的:在体外培养的单核细胞中观察DNA甲基化水平降低对LRP1基因功能的影响,分析其和动脉粥样硬化发病机制的关系。方法:在体外培养的单核细胞中,首先给予DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷干预,观察其LRP1的表达;然后单独或同时给予5-脱氧杂氮胞苷和转化生长因子β刺激干预后收集细胞,采用蛋白印迹法测定LRP1蛋白表达,RT-PCR检测LRP1 mRNA的表达。结果:1.DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷会促进单核细胞表达LRP1,和空白对照组存在显著差异(P＜0.05)。2.5-脱氧杂氮胞苷和转化生长因子β联合干预会进一步增加LRP1的表达,并在一定浓度范围内存在量效关系。结论:1、单核细胞LRP1基因的DNA甲基化水平降低,有助于基因的高表达。2、基因的DNA甲基化修饰,对其他外源性基因调控机制可能存在允许或增强机制。第三部份DNA甲基化修饰对血管平滑肌细胞LRP1的表达及其对细胞增殖的影响背景:低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)是血管平滑肌细胞(VSMC)表面重要的脂蛋白受体,可能参与了动脉粥样硬化病程中VSMC迁移、分化增殖以及向泡沫细胞的转化过程,其表达机制还不完全清楚。DNA甲基化作为基因的表观遗传学调控机制,可能参与了基因的表达调节。目的:观察DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷对培养的VSMC的LRP1基因表达mRNA的影响,并进一步观察培养的VSMC在5-脱氧杂氮胞苷干预后其细胞生物学行为有无变化及两者之间的关系。方法:在体外培养的VSMC中,首先给予DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷干预,观察其LRP1的表达;培养的VSMC给予血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)刺激,诱导其增殖和迁移,然后给予5-脱氧杂氮胞苷干预,采用台盼兰染色活细胞计数、四唑盐(MTT)比色法观察细胞的增殖,刮伤实验模型法检测细胞的迁移并对检测结果进行统计学分析。结果:1.DNA甲基化抑制剂5-脱氧杂氮胞苷会促进培养的血管平滑肌细胞高表达LRP1,和空白对照存在显著差异(P＜0.05)。2.PDGF组细胞增殖和迁移水平较空白对照组增加,两组间有统计学差异(P＜0.05),5-脱氧杂氮胞苷干预组VSMC的增殖、迁移水平降低,两组间存在统计学差异(P＜0.05)。结论:1.血管平滑肌细胞LRP1基因的DNA甲基化水平降低,则基因的表达增加,提示DNA甲基化修饰参与VSMC的LRP1表达调控。2.DNA甲基化修饰后可能通过影响LRP1的表达而影响细胞的生物学行为特性。