可注射原位成型水凝胶能均匀混合负载活性治疗分子和/或细胞,并可通过微创手术注射到体内而填充任何形状的病损部位,具有与天然细胞外基质类似的三维亲水网络结构,在药物和细胞载体以及组织再生等生物医用领域受到越来越多的关注。甲壳素,一种重要的可再生含氮天然多糖,在自然界中的产量仅次于纤维素,具有优异的生物相容性和生物可降解性,甲壳素及其衍生物是一类有开发前景的可注射水凝胶生物医用材料。本课题组选择“绿色”溶剂体系—碱（Na OH,KOH或Li OH）/尿素水体系在均相下已经成功合成了新型温敏性羧甲基甲壳素（CMCH）和羟丙基甲壳素（HPCH）。本论文在此基础上,首先将苯酚基团引入CMCH分子链,通过酶交联提高凝胶强度;然后将Diels-Alder点击反应和席夫碱反应分别引入到HPCH凝胶体系中,通过双交联（物理和化学）的方式提高凝胶强度。并初步探讨了它们的生物相容性以及在三维细胞培养方面的应用。第一章,简要概述了甲壳素基水凝胶和可注射原位成型水凝胶在生物医用领域的研究进展,还介绍了三维细胞培养发展及其应用研究。第二章,在水溶性CMCH的基础之上,引入苯酚基团合成了可酶交联的酪胺改性羧甲基甲壳素（CMCH-Tyr）聚合物。CMCH-Tyr聚合物在辣根过氧化物酶（HPR）和过氧化氢（H2O2）的共同作用下可原位凝胶。与温敏原位成型的物理交联CMCH水凝胶相比,酶交联CMCH-Tyr水凝胶具有更好的力学性能。同时,可通过调节HRP的用量控制凝胶时间,调节H2O2的用量控制凝胶强度。体外细胞实验和动物体内实验表明,CMCH-Tyr水凝胶具有良好的可注射性和生物可降解性以及优异的细胞和组织相容性,有望作为支架材料应用到细胞三维培养和组织修复领域。第三章,在温敏性HPCH的基础之上,引入呋喃环,合成了温敏性可双交联的呋喃改性羟丙基甲壳素（FGE-HPCH）聚合物。FGE-HPCH聚合物在交联剂双端马来酰亚胺PEG（MAL-PEG-MAL）存在下可以通过温敏性原位成胶,同时原位Diels-Alder点击反应形成第二交联网络,制备的双交联水凝胶的强度得到了很大的提高。FGE-HPCH双交联水凝胶可在溶菌酶的作用下体外降解。其强度和降解速率可通过调节呋喃环的摩尔取代度和交联剂MAL-PEG-MAL的用量调控。细胞实验表明,FGE-HPCH双交联水凝胶对细胞没有明显毒性,并且细胞在凝胶内通过三维培养能形成多细胞球。小鼠皮下实验表明,FGE-HPCH双交联水凝胶具有优异的可注射性以及原位凝胶能力,并且具有良好的生物可降解性和组织相容性。因此,FGE-HPCH双交联可注射水凝胶在体外三维培养和组织再生等生物医用领域具有很好的应用前景。第四章,在温敏性HPCH的基础之上,利用席夫碱反应,复合胶原蛋白（Col）,制备了可注射原位双交联水凝胶（HPCH-PEGDCHO-Col）。将Col引入HPCH凝胶体系并原位引入化学交联,不仅有效提高了HPCH凝胶的强度,而且促进了对细胞的粘附性及其细胞在凝胶内的增殖和多细胞球的增大。由于动态酰腙键（-CH=N-）的存在,凝胶还具备自愈合的功能。该类凝胶在生理条件下保持良好的稳定性,并且可以在溶菌酶的作用下体外降解,对细胞没有明显的毒性。可通过调节醛基与氨基摩尔比调控双交联水凝胶的强度和降解速率。体内实验表明,HPCH-PEGDCHO-Col双交联水凝胶具有优异的可注射性以及原位凝胶能力,并且具备良好的生物可降解性和组织相容性。因此,HPCH-PEGDCHO-Col可注射双交联水凝胶作为支架材料在肿瘤模型和软骨组织修复方面具有广阔的应用前景。第五章,采用温敏性HPCH水凝胶,负载肿瘤细胞（HepG2、HeLa和C6）进行三维培养。肿瘤细胞在HPCH水凝胶三维支架内生长良好,并能形成多细胞球,这种培养增殖方式与体内的肿瘤细胞相似,更接近于体内真实肿瘤组织。研究发现其中的HepG2细胞经过HPCH水凝胶三维培养后出现了去分化,干性水平升高,并表现出相应的生物学行为特征,例如更强的形成多细胞球的能力、迁移能力、耐药性以及皮下成瘤能力。因此,HPCH水凝胶材料有望应用在干细胞长期培养、肿瘤药物研发以及肿瘤模型等领域。