目的:严重烧伤后骨骼肌萎缩可引起许多并发症,严重影响患者的治疗、康复及预后。我们以前的研究表明,骨骼肌蛋白降解增强是烧伤后骨骼肌萎缩的重要原因。然而最近的研究表明,细胞凋亡通路的激活在骨骼肌萎缩过程中具有重要作用并且发生在骨骼肌蛋白降解之前,而且线粒体功能失常和细胞凋亡通路失调已被认为是老年因素等引起的骨骼肌萎缩发生、发展的机制。本研究拟进一步探讨严重烧伤后骨骼肌凋亡的发生、成肌细胞增殖活性的改变以及它们与骨骼肌萎缩的关系;烧伤后骨骼肌凋亡的可能机制;胰岛素对烧伤后骨骼肌凋亡的抑制作用及其机制。为了避免热力损伤对骨骼肌的直接作用,并能更好地理解烧伤后全身系统反应对骨骼肌的作用,我们选取远离烧伤部位的胫骨前肌作为研究对象。方法:雄性Wistar大鼠180只,随机分为3组:(1)假伤组;(2)严重烧伤组制作40%TBSA大鼠烫伤模型;(3)烧伤+胰岛素治疗组从烧伤后24小时开始,每隔12小时皮下注射胰岛素1次,持续5天(剂量逐日递增,分别为0.25,0.5,0.75,1.0,1.25 U/100g/次)。于伤后0、1、4、7、10、14天麻醉大鼠,麻醉前夜禁食,腹主动脉抽血并分离切取胫骨前肌及趾长伸肌并称重。胰岛素治疗组取标本时间为胰岛素注射后8分钟。骨骼肌凋亡的超微结构采用透射电镜(TEM)检测;骨骼肌凋亡的原位检测采用TdT酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL);骨骼肌凋亡的定量及血清INF-α、sFas、sFasL水平采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测;血清胰岛素水平采用放射免疫学方法进行检测;血糖水平采用Roche血糖仪进行检测;骨骼肌凋亡相关基因的表达采用实时定量PCR芯片进行检测;骨骼肌中Akt(蛋白激酶B)及磷酸化Akt、Bax、Bcl-2、Apaf-1和caspase-3蛋白表达水平采用Western blot方法进行检测;骨骼肌caspase-3、caspase-8、caspase-9活性水平采用相应试剂盒通过比色法或化学发光法进行检测。结果:1.严重烧伤可引起大鼠体重明显降低,胫骨前肌和趾长伸肌的肌肉重量下降、肌肉重量与体重比值减小。2.严重烧伤后大鼠胫骨前肌成肌细胞增殖活性(PCNA表达)明显降低,但经线性相关分析未发现与肌肉重量有显著相关。3.严重烧伤后大鼠胫骨前肌存在肌核凋亡现象,经线性相关分析,发现胫骨前肌凋亡指数与肌肉重量呈显著负相关。4.严重烧伤后血清TNF-α迅速升高并逐渐下降,随后血清sFasL与sFas比值升高。5.严重烧伤后死亡受体通路中的促凋亡信号分子,包括TNF-α、FasL、Tnfrsfla、Tnfrsf1b、Tnfsf6、Fadd、caspase-3、caspase-6和caspase-8均表达增高或活性增强。6.严重烧伤后线粒体通路中的促凋亡分子Bax、Bid、Apaf-1和caspase-9表达或活性增强,而抗凋亡分子Bnip1表达下调。另外抗凋亡基因Bcl211和Mcl1等表达也上调。7.严重烧伤后其它信号通路中的促凋亡分子,如Gadd45a、Cidea、Dapk1表达上调,同时部分抗凋亡基因ARC/Nol-3、IL-10、prokineticin-2也表达上调。8.胰岛素治疗可部分抑制烧伤引起的胫骨前肌凋亡增加。9.胰岛素治疗后烧伤大鼠胫骨前肌胰岛素信号通路中的核心信号蛋白Akt磷酸化水平显著升高,血清胰岛素水平升高。10.胰岛素治疗后烧伤大鼠血清TNF-α及sFasL和sFas比值下降。11.胰岛素治疗后,烧伤大鼠骨骼肌促凋亡分子包括TNF受体超家族中的Traf1,Bcl-2家族中的Bid3,caspase家族中的caspase-3和caspase-6,CARD家族中的Card6、Dapk1和Cidea基因/蛋白表达或活性水平下降。同时抗凋亡基因Prok2表达也下调。结论:1.严重烧伤后存在骨骼肌核凋亡现象,它是烧伤后骨骼肌萎缩的重要原因。2.严重烧伤后骨骼肌成肌细胞增殖活性下降,但它可能不是骨骼肌萎缩的主要原因。3.严重烧伤后骨骼肌凋亡的机制包括外源性通路(死亡受体介导的细胞凋亡信号通路)、内源性通路(线粒体介导的细胞凋亡信号通路)以及其它信号通路中与凋亡相关的分子的活化。4.胰岛素治疗可部分抑制烧伤引起的胫骨前肌凋亡增加,其机制是通过激活胰岛素信号通路来调节包括死亡受体信号通路分子、caspases、Bcl-2家族调节蛋白及其它与凋亡相关的信号分子,从而达到抑制烧伤后骨骼肌凋亡的目的。