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研究目的铁死亡是近年发现的一种非凋亡非坏死的程序性细胞死亡方式,其调控机制与传统的凋亡坏死通路存在明显差异。目前关于铁死亡的调控机制仍处于探索阶段。本研究探讨支链氨基酸转氨酶2(Branched chain amino acid transaminase 2,BCAT2)在药物诱导人肿瘤细胞铁死亡中的作用及其分子机制。研究方法(1)CCK-8筛选铁死亡诱导剂Erastin、索拉非尼(sorafenib,SOR)、柳氮磺嘧啶(sulfasalazine,SAS)诱导人胰腺癌细胞(Aspc-1)、人肝癌细胞(Hep G2)细胞半数死亡的浓度。(2)CCK-8检测铁死亡抑制剂ferrostatin-1、凋亡抑制剂ZVAD-FMK、坏死抑制剂necrosulfonamide对Erastin、索拉非尼(sorafenib)、柳氮磺嘧啶(sulfasalazine)诱导Aspc-1及Hep G2细胞死亡的挽救作用。(3)Western blot检测铁死亡诱导剂(Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶)处理后的Aspc-1及Hep G2细胞内胆固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP1),磷酸化AMP依赖的蛋白激酶(Phospho-AMP activated protein kinase,p-AMPK),支链氨基酸转氨酶2(Branched chain amino acid transaminase 2,BCAT2),支链氨基酸转氨酶1(Branched chain amino acid transaminase 1,BCAT1)蛋白表达水平。(4)qRT-PCR检测铁死亡诱导剂(Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶)处理后的Aspc-1及Hep G2细胞内BCAT2及BCAT1的m RNA表达水平。(5)染色质免疫共沉淀法(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)检测铁死亡诱导剂(Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶)处理后的Hep G2细胞内SREBP1与BCAT2启动子区结合能力。(6)AMPK激活剂(AICAR)与抑制剂(Compound C)分别与Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶共同处理Aspc-1及Hep G2细胞,Western blot检测各组BCAT2蛋白表达水平。(7)过表达BCAT2的Aspc-1、Hep G2细胞经Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后:CCK-8法检测细胞活性变化;铁离子检测试剂盒(Iron Assay Kit)、丙二醛检测试剂盒(Malondialdehyde Assay Kit)、谷胱甘肽检测试剂盒(Glutathione Assay Kit)分别检测铁离子、丙二醛、还原型谷胱甘肽水平的改变;谷氨酸检测试剂盒(Glutamate Assay Kit)检测细胞内谷氨酸水平。(8)将沉默BCAT2的Aspc-1和Hep G2细胞分别给予Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后,CCK-8检测细胞活性的变化;铁离子检测试剂盒(Iron Assay Kit),谷胱甘肽检测试剂盒(Glutathione Assay Kit),丙二醛检测试剂盒(Malondialdehyde Assay Kit)分别检测细胞内铁离子水平,还原型谷胱甘肽水平及丙二醛水平。谷氨酸检测试剂盒(Glutamate Assay Kit)检测细胞内谷氨酸水平。Western blot检测肿瘤细胞内BCAT2蛋白表达水平。(9)将Aspc-1和HepG2细胞分别给与如下处理:DMSO(对照组)、索拉非尼组、柳氮磺嘧啶组、索拉非尼+BCAT2 sh RNA1组、柳氮磺嘧啶+BCAT2sh RNA1组、索拉非尼+柳氮磺嘧啶组。CCK-8法检测各组细胞活性差异;丙二醛检测试剂盒(Malondialdehyde Assay Kit)检测各组细胞内脂质过氧化物水平。(10)将Aspc-1和Hep G2细胞分别作如下分组:DMSO(对照组)、索拉非尼组、柳氮磺嘧啶组、索拉非尼+柳氮磺嘧啶组、索拉非尼+柳氮磺嘧啶组+ferrostatin-1组。Western blot检测各组BCAT2蛋白表达水平。(11)用鼠源性胰腺癌细胞Panc02构建胰腺癌皮下瘤模型,将荷瘤小鼠随机分为四组:对照组、索拉非尼组、柳氮磺嘧啶组、索拉非尼+柳氮磺嘧啶组。观察各组小鼠皮下瘤生长速度及各组肿瘤组织BCAT2 m RNA的表达。研究结果(1)CCK-8结果显示Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶诱导Aspc-1细胞半数致死量的浓度分别为10μmol/L、5μmol/L、1 mmol/L;诱导Hep G2细胞半数致死量的浓度分别为20μmol/L、10μmol/L、2 mmol/L。(2)Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶诱导Aspc-1和HepG2细胞死亡作用可以被ferrostatin-1(铁死亡抑制剂)挽救,但不能被ZVAD-FMK(凋亡抑制剂)、necrosulfonamide(坏死抑制剂)挽救。(3)Western blot结果显示Aspc-1和HepG2细胞在Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后BCAT2蛋白表达水平下调;AMPK磷酸化被激活;SREBP1蛋白水平减低;BCAT1蛋白水平无变化。(4)qRT-PCR结果显示Aspc-1和HepG2细胞在Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后BCAT2 m RNA水平下调,而BCAT1 m RNA水平无明显变化。(5)染色质免疫共沉淀实验结果显示铁死亡诱导剂处理后HepG2细胞中SREBP1与BCAT2启动子区结合减少。(6)AMPK抑制剂Compound C可以逆转Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶对BCAT2的抑制作用(7)过表达BCAT2的Aspc-1和Hep G2细胞给予Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后,与对照组相比,细胞内铁离子浓度未见明显变化;丙二醛水平降低;谷氨酸释放水平,细胞内还原型谷胱甘肽及谷氨酸水平增高;细胞活性增高。(8)沉默BCAT2的Aspc-1和Hep G2细胞给予Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶处理后,与对照组相比,细胞内铁离子水平无明显变化;丙二醛水平增高;谷氨酸释放水平,细胞内还原型谷胱甘肽及谷氨酸水平降低;细胞活性降低。(9)联合索拉非尼及柳氮磺嘧啶可显著升高细胞中丙二醛水平,促进细胞死亡数增加,而这一作用可以被ferrostatin-1(铁死亡抑制剂)逆转。(10)联合索拉非尼及柳氮磺嘧啶可显著降低肿瘤细胞中BCAT2的蛋白表达水平。(11)与索拉非尼及柳氮磺嘧啶单药处理相比,索拉非尼联合柳氮磺嘧啶可以显著抑制鼠胰腺癌皮下瘤肿瘤生长速度及肿瘤组织中BCAT2 m RNA的表达水平。结论(1)Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶可以诱导人胰腺癌细胞及肝癌细胞铁死亡,AMPK/SREBP1/BCAT2通路在这一过程中发挥重要的作用。(2)BCAT2通过促进内源性谷氨酸的产生抑制Erastin、索拉非尼、柳氮磺嘧啶诱导的肿瘤细胞铁死亡。(3)联合应用柳氮磺嘧啶及索拉非尼可以显著促进肿瘤细胞发生铁死亡,这一过程与BCAT2表达水平下调有关。