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A型流感病毒在世界范围内的流行对养殖业造成了巨大的经济损失,在不同物种之间的传播对公共卫生安全形成了严重的隐患。猪气管上皮细胞中同时具有禽源流感病毒和人源流感病毒结合的受体,被当作流感病毒的混合器,能够将不同亚型的流感病毒在体内重配和组装成新的流感病毒,从而增加病毒免疫逃逸和跨种传播的风险。流感病毒感染的过程需要宿主蛋白的参与,因此,研究流感病毒与宿主蛋白互作的机制有利于挖掘药物和抗病育种的靶标。课题组前期在人肺腺癌细胞A549细胞系上,通过规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regular interspersed short palindromic repeats,CRISPR）全基因组敲除文库,鉴定了H7N9感染和增殖相关的必需宿主因子,其中发现细胞附着蛋白2（Cytohesin 2,CYTH2）在流感病毒感染的过程中参与病毒的内吞,调控病毒囊膜和内体膜的融合。为了进一步研究CYTH2介导流感病毒内吞的机制和评价cyth2基因作为抗流感病毒药物和抗病育种靶标的潜在可能性。本课题研究了猪cyth2基因对流感病毒在新生猪气管上皮细胞NPTr细胞系和猪肺泡巨噬细胞3D4细胞系中增殖的影响,并解析了CYTH2介导流感病毒内吞的机制。具体研究内容和结果如下:1猪cyth2基因同源性分析本实验室前期发现人cyth2基因能够调控流感病毒的感染,为了评价猪cyth2基因对流感病毒感染的影响,首先,通过对人和猪cyth2基因进行同源性分析,结果表明猪CYTH2与人的CYTH2氨基酸序列同源性较高（99.50%）,并且二者有完全相同的结构域,发挥调节下游Arf蛋白信号转导的功能。因此,本课题研究了猪cyth2基因能否在猪的细胞中同样发挥调控流感病毒感染的功能。2猪cyth2基因对流感病毒增殖的影响为了研究猪cyth2基因对流感病毒增殖的影响,首先,通过CRISPR/Cas9技术在NPTr细胞上构建cyth2基因敲除细胞系（NPTr-△CYTH2）,利用逆转录病毒过表达系统在NPTr-△CYTH2构建了cyth2基因回补细胞系（NPTr-C-△CYTH2）。然后检测细胞上清乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）的释放,检测的结果表明猪cyth2基因的敲除和回补不影响NPTr细胞的活力。进一步通过流感病毒感染NPTr-nontarget,NPTr-△CYTH2,NPTr-C-△CYTH2细胞,测定病毒滴度发现敲除cyth2基因抑制了流感病毒在NPTr细胞上的增殖,而回补cyth2基因后这种抑制效果消失。最后用相同的方法在猪的3D4细胞上构建了cyth2基因的敲除细胞系和回补细胞系,通过流感病毒感染后发现cyth2基因的敲除同样能够抑制流感病毒在3D4细胞上的增殖。3猪CYTH2对流感病毒内吞的影响前期实验室的研究结果表明,在敲除cyth2基因的A549细胞中,病毒粒子会停留在内吞泡中,病毒的囊膜无法与内体膜融合,从而抑制病毒粒子的释放。为了进一步研究猪cyth2基因对流感病毒内吞的影响,首先通过荧光标记病毒进行示踪,发现猪cyth2基因的敲除不影响流感病毒在NPTr细胞的吸附和内化。然后通过荧光定量检测细胞内流感病毒的v RNA和m RNA,试验结果表明敲除cyth2基因抑制了流感病毒在NPTr细胞内从内体转运到复制转录的过程。进一步通过酸化试验,用酸性PBS（p H=5.0）处理从而绕过病毒内体转运的阶段,提前释放病毒粒子,发现猪CYTH2影响流感病毒在内体的转运。最后通过共聚焦观察NPTr-△CYTH2细胞中流感病毒与细胞内RAB5（初级内体标志物）和RAB7（次级内体标志物）的共定位,实验结果表明猪cyth2基因的敲除抑制了流感病毒从初级内体转运到次级内体的过程。综上所述,本研究在NPTr细胞中发现猪CYTH2通过参与流感病毒从初级内体转运到次级内体的过程,从而影响流感病毒的增殖。