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目的:本课题选用柳氮磺胺吡啶(SAS)作为氧化应激诱导剂,复制氧化应激模型,以人卵巢上皮性癌顺铂敏感细胞(SKOV3、A2780)与耐药细胞(SKOV3/DDP、OVCAR-3)为研究对象,研究卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞(SKOV3/DDP、OVCAR-3)中程序性坏死途径的作用,以及多功能蛋白p62/SQSTM1(简称p62蛋白)在此途径中的可能调控机制,揭示人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞中程序性坏死途径的作用及其调控机制,为靶向程序性坏死途径、克服肿瘤耐药提供新思路。方法:(1)利用MTT法检测SAS对人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞生存率的影响。(2)利用MTT法检测SAS和程序性坏死抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)联合作用对人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞生存率的影响。(3)RTCA法检测Nec-1与SAS联合作用对人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP细胞生存率的影响。(4)利用Western blotting方法检测SAS对人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL及磷酸化蛋白表达水平的变化。(5)免疫共沉淀法检测RIP1、RIP3复合体表达情况。(6)利用Western blotting方法检测SAS对人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞p62蛋白表达的影响。(7)利用Western blotting方法检测人卵巢上皮性癌SKOV3细胞和人卵巢上皮性癌A2780细胞中过表达zz结构域突变的p62蛋白(zz-p62)对程序性坏死相关蛋白的影响。结果:(1)MTT结果显示,由SAS诱导的人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞死亡过程中,与对照组比较,不同浓度SAS作用于人卵巢上皮性癌SKOV3、SKOV3/DDP、A2780、OVCAR-3细胞,随着SAS浓度的增加细胞生存率均逐渐降低,并呈现剂量依赖性。SAS 0.5 mM作用人卵巢上皮性癌SKOV3细胞,SAS 2 mM作用人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞,细胞生存率分别为(81.9±1.4)%及(80.3±1.5)%,SAS 0.5 mM作用人卵巢上皮性癌A2780细胞,SAS 2 mM作用人卵巢上皮性癌OVCAR-3细胞,细胞生存率分别为(78.0±1.9)%及(77±5.6)%,因此选取SAS 0.5 mM作用人卵巢上皮性癌SKOV3细胞,SAS 2 mM作用人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞,SAS 0.5 mM作用人卵巢上皮性癌A2780细胞,SAS 2 mM作用人卵巢上皮性癌OVCAR-3细胞做后续实验。与人卵巢上皮性癌SKOV3、A2780细胞比较,相同浓度的SAS作用人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP、OVCAR-3细胞,人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP、OVCAR-3细胞生存率降低程度不明显。(2)RTCA生存率曲线表示细胞数,曲线的斜率表示细胞生长速率。首先观察RTCA生存率曲线高低情况,与SAS组比较,Nec-1 10μM与SAS联合作用组人卵巢上皮性癌SKOV3细胞生存率曲线低,而人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞生存率曲线高。继续观察RTCA实时曲线的斜率,结果显示,在SKOV3细胞与对照组control比较,SAS组曲线斜率降低;与SAS组比较,Nec-1 10μM与SAS联合作用组,曲线增长斜率没有差异;在人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞中,与对照组control比较,SAS组曲线斜率降低且呈负性增长,与SAS组比较,Nec-1 10μM与SAS联合作用组曲线斜率增高,有统计学意义。(3)Western blotting结果显示,SAS作用的人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞程序性坏死相关蛋白磷酸化RIP1、RIP3、MLKL表达均在SAS作用12h时增加;在SAS作用人卵巢上皮性癌OVCAR-3细胞12h时,程序性坏死相关蛋白磷酸化RIP1、RIP3表达增加,而程序性坏死相关蛋白磷酸化MLKL表达没有变化;SAS作用的人卵巢上皮性癌SKOV3、A2780细胞程序性坏死相关蛋白磷酸化RIP1、RIP3、MLKL均不表达。(4)免疫共沉淀结果显示,SAS作用的人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞中可见RIP1与RIP3复合体表达。(5)Western blotting结果显示,SAS作用人卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞12h时p62蛋白表达量增多;在SAS作用人卵巢上皮性癌OVCAR-3细胞6h时p62蛋白表达量增多;SAS作用的人卵巢上皮性癌SKOV3、A2780细胞p62蛋白均不表达。(6)Western blotting结果显示,在人卵巢上皮性癌SKOV3细胞和A2780细胞中,将zz结构域缺失的p62蛋白过表达,可见程序性坏死相关蛋白磷酸化RIP1、RIP3、MLKL比值均下降。结论:(1)与人卵巢上皮性癌顺铂敏感细胞比较,人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP、OVCAR-3对SAS不敏感,并且在SAS诱导SKOV3/DDP、OVCAR-3细胞损伤时,存在程序性坏死细胞死亡途径,应用程序性坏死抑制剂(Necrostatin-1,Nec-1)抑制程序性坏死,可见细胞生存率增加,提示在耐药细胞中促进程序性坏死途径可能成为抗肿瘤药物治疗的新途径。(2)与人卵巢上皮性癌顺铂敏感细胞比较,氧化应激诱导人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP及OVCAR-3细胞损伤时,p62蛋白表达增加,在顺铂敏感细胞SKOV3、A2780过表达zz结构域突变的p62蛋白,程序性坏死相关蛋白磷酸化RIP1、RIP3、MLKL表达均降低,提示p62蛋白可能调控程序性坏死途径,这为寻找克服肿瘤耐药的治疗靶点提供理论依据。