灵芝(Ganoderma lucidum)作为一种重要的药用真菌,具有较强的木质素降解能力。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,作为灵芝分泌的胞外酶之一,在灵芝生长发育过程中通过降解环境木质素,为灵芝提供营养成分,促进灵芝的发育及形态的产生。研究灵芝漆酶的变化规律对灵芝的产量和质量具有重要意义。目前对灵芝漆酶降解木质素机制的研究很少,漆酶与其编码基因发挥作用的机理不明确,因此本文对已经公布的灵芝漆酶同源基因及推断的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对灵芝漆酶基因在灵芝生长的不同时期、不同浓度Cu2+诱导下的表达情况进行研究,以了解漆酶基因在灵芝生长过程中的变化规律,为探索漆酶在灵芝中的表达机制研究提供理论依据。本文研究内容为以下几个方面:(1)生物信息学分析显示不同漆酶氨基酸序列的组成有所差异,使用Signal4.1Server对12个漆酶同源基因进行信号肽预测发现,所有氨基酸序列N端中都具有信号肽,信号肽氨基酸残基在18-24个aa之间;通过NCBI比对后,所有的漆酶基因都分别具有漆酶特征序列L1-L4,以及3个保守的铜氧化酶结构域,说明推断的氨基酸序列属于MCO的一类,同时LCC1与LCC2、LCC3以及LCC5分别有77%、80%和77%的相似性,而且聚类分析也显示这四个漆酶基因同属于一组。内含子位置1和2在所有漆酶基因中都存在,可能是最保守的内含子。在聚类分析中,预测漆酶氨基酸序列的一致性存在差异,分布在47-100%之间。LCC13与LCC4、LCC7更接近,虽然在内含子位置分组中属于第3组,但也可以认为其属于第A组。同时LCC8与B组更接近。对于LCC10和LCC11是内含子数量相对较少的基因,这需要进一步的实验说明其内含子的情况。(2)利用PDA固体培养基方式培养,采用ABTS法和硫酸—苯酚法分别对7种灵芝属不同菌种的漆酶活性和多糖含量进行测定。结果显示,灵芝漆酶在菌丝体时期活性较高,在本研究中供试菌种的生长速度与漆酶活性的最大值都出现在第4或第6天,可将第4天作为优化实验培养的终点。通过对7种灵芝属不同菌种生长与漆酶活性的研究,从生长速度、生物量、漆酶活性及多糖等因素综合分析,有柄树舌的漆酶活性明显高于对照云芝,且生长速度快,能够作为高产漆酶菌种的原始菌种。(3)采用木段栽培方法,利用RT-PCR法检测漆酶基因的转录水平。分析12个漆酶基因在灵芝S3不同培养时期的转录水平,阐明灵芝漆酶基因的变化规律。结果显示,在灵芝S3不同培养时期,检测到LCC9和LCC10未发生转录;较对照的相对表达量,LCC1、LCC3、LCC5基因的表达在第一个时期(现蕾期)最高,LCC2、LCC7、LCC8、LCC11、LCC12及LCC13的表达最高点出现在第三个时期(弹孢前期)。在整个培养期间,LCC4较对照的相对表达量都较高,且表达的峰值在第四个时期(弹孢后期)。漆酶基因相对表达丰度分析表明,LCC8、LCC2、LCC12、LCC4分别是漆酶基因在现蕾期、菌盖形成期、弹孢前期以及弹孢后期主要的漆酶转录基因。推断LCC8、LCC2、LCC12可能分别参与灵芝生长过程中前期木质素降解、菌盖的形成以及弹孢等过程。LCC4基因的表达对灵芝漆酶合成具有重要作用。(4)研究不同浓度铜离子对灵芝S3菌丝体生长、鲜干重、漆酶活性以及漆酶基因表达的影响,为金属离子对漆酶的影响提供依据。结果显示,在灵芝S3菌丝体生长过程中,除10M铜离子处理外,1.25M、2.5M、5M铜离子处理生长速率、质量、漆酶活性以及漆酶基因的表达都明显高于对照,漆酶活性最大值出现在菌丝体培养的第6天,且最佳铜离子浓度为5M。利用RT-PCR对漆酶基因的表达进行分析发现,LCC5、LCC10、LCC13基因在对照和处理的菌丝体中都没有检测到表达,其他漆酶基因在5M铜离子处理后,都出现显著上调。特别是LCC1,增加最为明显,推测其可能是灵芝S3菌丝体合成漆酶的关键基因。