两株极端嗜盐古菌的多相分类学研究及固定化羟氨苯歧位酶基因工程菌细胞催化制备4,6-二氨基间苯二酚的研究

来源 :中国科学院微生物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yu_jixing
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本研究采用多相分类学方法,即运用表型特征、细胞化学组分以及基于16SrRNA基因的分子系统进化关系来确定两株分别来自内蒙古吉兰泰盐湖的菌株NG4和新疆艾比盐湖的菌株BD-3的分类学地位。   基于16S rRNA基因的系统发育树,细胞极性脂组分分析,生理生化特性比较,G+C mol%含量表明菌株NG4T和BD-3T分别为Halobacterium属和Haloarcula属的成员。系统发育关系较近的Halobacterium salinarum和Halobacteriumnor icense在上与菌株NG4T在生理生化特性存在着一定区别。DNA-DNA同源性分析表明菌株NG4T与Halobacterium属的全部成员的杂交同源率都低于60%。表明菌株NG4T应为Halobacterium属的新成员,命名为极端嗜盐杆菌(Halobacterium jilantaiense),模式菌株为NG4T。在生理生化特性上菌株BD-3T与Haloarcula属其它种也存在着一定区别。DNA-DNA同源性分析表明菌株BD-3T与Haloarcula属的全部成员的杂交同源率都低于60%。表明菌株BD-3T应为Haloarcula属的新成员,命名为水解淀粉盐小盒菌(Haloarcula amylolytica),模式菌株为BD-3T。   研究结果表明这两株菌株分别代表了两个新的嗜盐古菌物种:Halobacteriumjilantaiens和Haloarcula amylolytica,丰富了嗜盐古菌的分类。   聚对苯撑苯并双噁唑(PBO)纤维的强度、模量、耐热性和抗燃性等主要性能指标均属目前有机和无机纤维之最,被誉为21世纪的超级纤维,并且开始作为高性能有机纤维和首选的工业新材料应用于军事、航空航天及汽车等领域。在PBO的所有合成路线中,4,6-二氨基间苯二酚(DAR)是必需的中间体。目前DAR的制备均采用纯化学工艺,普遍存在着制备工艺复杂、生产成本高、能量消耗高、环境污染严重等问题,从而制约了PBO的开发和广泛应用。本研究构建了羟氨苯歧位酶基因工程菌,经发酵培养和海藻酸钙包埋法固定化之后作为生物催化剂,在温和条件下,水相催化2-氨基-4-羟氨酚的分子内重排合成DAR。合成产物经络合萃取工艺分离,重结晶纯化得到高纯度DAR盐酸盐。采用生物催化合成DAR的工艺路线原子经济性高、制备工艺简单、反应条件温和、底物转化率高,并且克服了传统工艺中的严重污染问题,为DAR的制备提供了一种新的合成方法。   本论文具体研究内容如下:   1.羟氨苯歧位酶基因工程菌株的构建   以降解对氯硝基苯的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1的基因组DNA为模板,根据其羟氨苯歧位酶基因序列分析,设计特异性引物扩增羟氨苯歧位酶基因。纯化后的PCR产物经过Eco RI和Hind III双酶切处理,与经相同酶切处理过的高效表达质粒载体pET21a连接。将验证后的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到羟氨苯歧位酶的高效表达的基因工程菌株。   2.羟氨苯歧位酶基因工程菌的培养及固定化   羟氨苯歧位酶基因工程菌在氨苄青霉素抗性的LB培养基上划线纯化、接种至氨苄青霉素抗性的LB液体中37℃发酵培养。待发酵液的OD600达到0.3-0.5时加入IPTG诱导剂然后转移至20℃诱导表达。离心收集菌体与海藻酸钠溶液混合成均匀浆料,经过滴制法在氯化钙溶液中成球,钙化交联后即得固定化细胞。   3.DAR的生物催化工艺   DAR的生物化工合成工艺由化学操作单元和生物催化操作单元两部分组成。在化学操作单元,反应起始物2-氨基-4-硝基苯酚被还原为2-氨基-4-羟氨酚作为反应底物;在生物催化单元以羟胺苯歧化酶基因工程菌株固定化细胞作为催化剂,将底物2-氨基-4-羟氨酚转化为4,6-二氨基间苯二酚。   4.产物的分离、纯化与表征   目标产物稀溶液的络合萃取分离工艺以D2EHPA为萃取剂,正辛醇为助溶剂和煤油稀释剂,三者的体积比20/30/50。利用络合萃取的pH摆动效应,将合成产物从中性或弱酸性条件下萃取富集到有机相,而后在强酸性条件下将产物反萃取到水相。反萃物溶液在旋转蒸发仪上蒸馏浓缩得到产物粗晶体。粗晶体溶于盐酸中经活性炭脱色,重结晶干燥得到无色透明晶体。采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)、氢核磁(1HNMR)和元素分析(Element analysis)等分析方法验证了重结晶产物的结构。
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