新生儿脑膜炎是出生后28天内的婴儿脑膜或脊髓膜的炎症。虽然抗生素得到了广泛应用,但耐药菌株的不断出现及其严重的神经系统后遗症,使得该病仍然是全球新生儿十大感染之一,在发达和发展中国家均具有很高的发生率和死亡率。大肠埃希菌(E.coli)是目前新生儿脑膜炎最主要的致病菌,80％是由K1荚膜抗原阳性大肠埃希菌株所引起。1980年Silver等人首次在新生儿脑膜炎患儿的脑脊液中分离出E. coli K1菌株RS218,其血清型O18:K1:H7,是新生儿脑膜炎的典型血清型,在全球均有广泛的分布。　　根据目前E.coli K1菌株引起新生儿脑膜炎致病机制的研究,其毒力因子主要包括K1荚膜、外膜蛋白A、I型纤毛和细胞毒素坏死因子等。这些毒力因子通过对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的粘附和侵袭,可以使E.coli以活菌的形式在HBMEC中复制或直接进入脑组织,进一步引起脑膜和脑脊膜的炎症。　　Ⅵ型分泌系统(T6SS)是2006年哈佛大学医学院的John Mekalanos在霍乱弧菌中发现的新型分泌系统,之后针对T6SS分子生物学特征以及功能的研究在全球各个实验室不同致病菌株中报道。通过分析前期基因芯片结果,我们发现该分泌系统在新生儿脑膜炎的11株E.coli临床分离株中普遍存在,包括K1菌株RS218。该菌株中大肠埃希菌毒力相关基因簇(EVF)有evfC、evfK、evfW和hcp等12个基因与已报道的T6SS核心且保守的基因同源,表明该基因簇可能负责编码T6SS。有趣的是该菌株含2个溶血素共调节蛋白(Hcp家族蛋白),Hcp1和Hcp2,它们是近两年作为T6SS效应分子和组成蛋白报道最多的蛋白。为了鉴定这一新型分泌系统及其Hcp家族蛋白在大肠埃希菌性新生儿脑膜炎的致病过程中的作用,我们以E.coli K1菌株RS218为研究对象,以HBMEC细胞为新生儿脑膜炎的体外模型,利用分子生物和细胞生物学等手段展开以下三部分研究:　　1.利用一步PCR失活目的基因法,我们构建了T6SS及其相关核心基因的敲除株,通过细菌和HBMEC细胞相互作用,检测敲除株与野生株对HBMEC的粘附和侵袭能力的差异。同时,利用酵母凝集试验、Western Blot、细菌运动性检测和半定量PCR等方法,比较了已知毒力因子在T6SS敲除株(△T6SS)与野生株之间表达水平的差异。结果表明,T6SS及其核心基因evfC、evfK、hcp2的敲除株对HBMEC的粘附和侵袭能力显著降低,且△16SS并没有影响已知毒力因子的表达或功能。证明了T6SS参与了E.coli K1菌株引起新生儿脑膜炎致病过程,且不依赖于已知的毒力因子。　　2.为进一步研究T6SS分子生物学特征,我们收集了野生株和△T6SS的分泌蛋白,通过2-DE分离、β-内酰胺酶活性分析和Western Blot检测,我们发现两者的分泌蛋白谱有明显差异,说明T6SS负责一些蛋白的分泌或影响了相关蛋白的表达,而Hcp1蛋白是T6SS的效应分子。细菌蛋白定位等实验结果表明,Hcp家族蛋白定位在外膜中,推测Hcp2可能作为T6SS的组成蛋白,且以聚合体形式定位于细菌外膜中。结合Hcp家族蛋白的过表达菌株对HBMEC粘附和侵袭的检测结果,我们发现,Hcp2的过表达菌株对HBMEC的粘附和侵袭能力增加,而Hcp1的过表达菌株则相反。本部分研究阐述了E.coli K1菌株T6SS的分子生物学特征以及Hcp1的分泌途径,证明了Hcp家族蛋白在E.coli K1菌株T6SS的结构和功能发挥过程中扮演着不同的角色。　　3.通过一系列细胞相关的实验手段,包括流式细胞检测、荧光共聚焦、WesternBlot和蛋白移位实验等,我们发现Hcpl可以诱导HBMEC形态改变、骨架重排、Caspase8介导的细胞凋亡以及大量炎症因子的释放,且Hcp1没有进入HBMEC内部。　　综上所述,在E.coli K1菌株引起新生儿脑膜炎过程中,Hcp2可能作为T6SS的组成蛋白以聚合体形式定位于细菌外膜中,负责T6SS的组装,并参与了细菌与HBMEC粘附和侵袭过程。当T6SS组装完成后,T6SS可以将效应蛋白Hcp1分泌到胞外,可能通过与宿主细胞HBMEC受体特异性的结合,进一步诱导细胞毒性作用,从而有利于E.coli K1菌株对HBMEC的粘附和侵袭,并最终导致新生儿脑膜炎的发生。　　本研究通过微生物学、分子生物学和细胞生物学等手段,阐明了新生儿脑膜炎致病菌E.coli K1菌株中T6SS的存在和分子生物学特征及其Hcp家族蛋白的分泌途径、细胞生物学特点,揭示了E.coli K1菌株T6SS及其Hcp家族蛋白与大肠埃希菌性新生儿脑膜炎致病机制的关联,为该病的治疗,药物和疫苗的研发奠定了基础。