背景与目的宫颈癌是世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一,据2014年国际卫生组织(word health organization,WHO)统计,宫颈癌的每年新发病例约有50万例,死亡病例约占27万例,其中85%的病例在发展中国家。而我国每年新发病例就达13.15万,约占世界宫颈癌新发病例的28.8%,且呈年轻化趋势。现全球每年约有20万妇女死于此病,其中有5.3万发生于我国,是严重威胁我国妇女生命健康的恶性肿瘤。传统的广泛性子宫切除术(radical hysterectomy, RH)是治疗早期宫颈癌的首选标准术式,该术式要求是除切除子宫外,还包括全部的宫旁组织(包括阔韧带、主韧带及子宫骶韧带)及1/3～1/2的阴道。该术式在获得了较好的临床疗效的同时,也因手术范围广,而带来了系列术后并发症。结合文献报道及本研究团队的长期随访研究发现RH术后并发症主要表现为盆腔脏器功能障碍：(1)以尿潴留、尿不尽感、尿失禁等症状为主要表现的膀胱功能障碍；(2)以便秘、大便干结等症状为主要表现的肛门直肠功能紊乱；(3)以缺乏润滑和性欲障碍等症状为主要表现的性功能障碍。进一步的研究发现：术中处理宫颈周围韧带时对盆腔自主神经(Pelvic autonomic nerve, PAN)的损伤是导致上述术后并发症产生的主要原因。PAN由腹下神经(Hypogastic nerve, HN).盆腔内脏神经(Plevic splanchnic nerve, PSN)、下腹下丛(inferior hypogastric plexus, HP)和由其发出的膀胱支、直肠支、阴道支和阴蒂支等组成。其中腹下神经为交感神经,使膀胱平滑肌舒张,导致膀胱扩张而储尿,同时收缩尿道括约肌阻止排尿,收缩肛门内括约肌、抑制直肠蠕动；盆腔内脏神经为副交感神经,作用与交感神经相反,起到收缩膀胱平滑肌同时舒张尿道括约肌而导致排尿,增强直肠蠕动,促进排便；下腹下丛由腹下神经和盆腔内脏神经汇合而成,包含有交感神经和副交感神经,因此下腹下丛及其发出的膀胱支、直肠支、阴道支和阴蒂支等同时具有腹下神经和盆腔内脏神经的功能。RH术中损伤PAN主要在以下步骤：(1)在贴近盆后壁切断子宫骶韧带(uterosacral ligament, USL)时损伤腹下神经导致术后尿失禁、便意明显及里急后重感等；(2)切断主韧带(cardinal ligament, CL)时损伤盆腔内脏神经及盆丛(pelvic plexus, PP,又称下腹下丛)导致术后尿储留、便秘等；(3)切断阴道旁组织(paracolpium complex, PC)时损伤盆丛的膀胱支、直肠支、阴道支和阴蒂支等可出现上述系列症状。因此在术中避免和减少对分布到膀胱、直肠及阴部的神经损伤是防止并发症发生的关键。为此有学者对RH手术进行了改良,目前将在术中保留了支配下尿道膀胱、肛门直肠和外阴阴道等盆腔器官自主神经的广泛性子宫切除术称为系统保留盆腔自主神经的广泛性子宫切除术(Systematic Nerve-sparing Radical Hysterectomy, SNSRH)。但该术式因基础解剖不明确、术中神经辨认困难、术式标准不一、术后保留神经无量化标准及疗效不能全面评估等原因未能在临床上广泛应用。识别和保护盆腔自主神经的手术理念源自上世纪20年代日本妇科专家冈林提出,60年代由小林隆正式实施,到1980年Sakamoto才第一次对该术式用英文报道,从而将此手术方式推向进步。该术式的核心是寻找并保留宫颈周围韧带内的神经,在初期,对主韧带内血管和神经组织的辨认依靠触觉、经验和解剖学标志,认为主韧带上面柔软的部分为血管部,下面坚硬的部分为神经部,切除其上的血管部,保留下面的神经部,但该方法缺乏理论上、解剖学上及组织学上的依据。接着有学者利用吸脂术暴露宫旁组织的支持结构,寻找主韧带中的盆腔自主神经,该方法的原理是通过超声波破坏韧带内结缔组织以暴露血管和神经,但因是否会导致术后无法判定韧带内是否有癌组织的存在影响后续的治疗而受到质疑。为更进一步了解宫颈周围韧带的精细解剖结构,本研究团队及国内外其他学者陆续利用病理组织学的方法对宫颈周围韧带中各韧带标本分别进行组织切片后行免疫组化染色,明确宫颈周围韧带内含有血管、神经(交感神经和副交感神经)、淋巴管及纤维组织,并以此推断周围韧带内神经脉管的大体分布。但上述方法的重心在于对单条韧带进行研究,仅能大致描述各韧带内神经血管的走行,未能对宫颈周围韧带内神经脉管结构进行整体描述。在80年代末至90年代初,由于计算机新图像处理技术与生物技术的发展从而使真实再现生物组织的三维图像成为可能。现如今,随着计算机图像三维重建技术已越来越广泛地应用于生物学领域,三维重建技术在医学领域的应用也日益广泛。研究报道,生物组织三维结构的成像技术主要包括以下几种：连续切片技术(Serial Section)、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)技术、B超、CT(Computed Tomography)等。不过,除了连续切片技术,其它成像方法的分辨力均在数毫米甚至更粗量级,无法显示出生物组织的精细结构。因此,为了解宫颈周围韧带内的精细显微组织结构,需通过结合组织连续切片技术与计算机三维重建技术的方法,才能构建出可清楚地显示和辨认宫颈周围韧带内神经脉管等显微组织结构的数字化三维模型。本团队自2011年起,探讨了利用组织连续切片数据集构建子宫主韧带内精细结构的方法并成功构建出子宫主韧带内神经脉管数字化三维模型。但目前尚未有关于构建完整的宫颈周围韧带内神经脉管数字化三维模型用以指导SNSRH手术的实施的报道。因此,本研究拟在前期研究的基础上通过获取RH术后的宫颈周围韧带整体标本,进行适当处理及标记后,经组织连续切片及染色,结合图像识别、定位配准、三维重建等技术,构建出完整的宫颈周围韧带及其内神经脉管的数字化三维模型,为SNSRH手术提供立体解剖学依据。材料与方法1.标本：选取2014年8月就诊于南方医科大学南方医院,经病理证实为宫颈鳞状细胞癌IB1期的宫颈癌患者1例,行经腹广泛性子宫切除术,术前行MRI与CT检查,并获取其原始扫描数据集。在术后收集宫颈周围韧带标本一套(包含部分宫颈组织、主韧带、子宫骶韧带及阴道旁复合体),且标本外侧缘经病理学检查证实无癌细胞浸润。2.取材：将术后切除的子宫连同其周围韧带展平放置于标本板上,辨认出双侧主韧带、骶韧带及阴道旁组织。将双侧主韧带、骶韧带及阴道旁组织作为一个整体,连同部分宫颈组织整体切除。为区分方向,用印度墨水标记双侧主韧带宫颈侧与上缘及骶韧带的宫颈侧、上缘及整个外侧面。3.包埋、制片及染色：标本常规固定、脱水后,利用穿刺针穿取4条略长于韧带标本的猪肝组织(直径约0.5mm)作为定位杆标记与标本一起进行石蜡包埋,冰冻30mmin后从标本宫颈侧由内向外进行连续切片,切片厚度为5μm,共切取1287张切片,以连续10张为一组按顺序挑选5张未脱片的切片分别进行HE染色、动脉弹力纤维特殊染色及免疫组化染色(特异性标记交感神经、副交感神经和淋巴管)。4.图像采集：对所有不同染色所制的连续切片进行图像采集。采用数字切片扫描系统进行扫描,先将玻片置于2×10倍下扫描地图,以确定扫描范围,再调整放大倍数至10×10倍,调整扫描精细度后进行全自动扫描,完成扫描后以BMP格式储存,共采集连续切片数据集640张。5.图片融合与配准：用Photoshop5.0软件分离出只有定位杆的图片后,利用Matlab软件的图像自动配准方法分别对5组切片图像进行自动配准,最后结合Photoshop软件手工配准调整微小差异。6.三维重建：将配准后的5组切片数据集图片导入Photoshop软件中,应用画笔工具分别画出血管、交感神经、副交感神经及淋巴管的轮廓。利用ACDSee软件将各组图片调至合适大小,分别导入Mimics软件中,经过自动定位图像、组织图片、内插值处理后,利用三维重建技术分别构建出宫颈周围韧带及韧带内血管、动脉、交感神经、副交感神经和淋巴管的数字化三维模型。静脉数字化三维模型的构建方法是通过Mimics软件中的布尔运算,将血管的二维蒙罩与动脉的二维蒙罩相减后得出,利用三维重建直接重建出静脉的数字化三维模型。最后将各个模型进行汇总,以该病人的基于MRI数据集构建的在体韧带数字化三维模型为参照对各个模型进行配准融合,构建出完整的宫颈周围韧带内神经脉管数字化三维模型。利用Mimics软件的透明化、测量等功能对模型进行分析。结果1.宫颈周围韧带及其内神经脉管的定性染色结果(1)子宫主韧带和阴道旁组织：由于获取标本时未将其分开,故作为一个整进行研究。①HE染色结果：可见大量纤维结缔组织、脂肪组织；丰富的血管,以中、小动静脉为主,可见丰富静脉窦及单层薄壁静脉；神经组织丰富；散在淋巴管,偶见淋巴组织和淋巴结。②特殊染色结果：动脉弹力纤维特殊染色结果显示弹力纤维呈蓝黑色,胶原纤维呈红色,肌纤维呈黄色。主韧带及阴道旁组织中胶原纤维含量较多,弯曲成弹簧状的弹力纤维见于动脉内皮,肌纤维含量极少,呈散在分布。③免疫组化染色结果：TH抗体特异标记交感神经结果阳性,VIP抗体特异标记副交感神经结果阳性,D2-40抗体特异标记淋巴管免疫组化染色结果阳性。证实主韧带及阴道旁组织中的自主神经包括交感神经和副交感神经,还包括交感神经节和副交感神经节。淋巴管呈散在分布,无明显规律。(2)子宫骶韧带①HE染色结果：含有大量纤维结缔组织、脂肪组织,丰富的神经纤维、血管,以中、小、微动静脉为主,且血管多与神经伴行,可见散在分布的淋巴管,偶见淋巴结。②特殊染色结果：动脉弹力纤维特殊染色结果显示弹力纤维呈蓝黑色,胶原纤维呈红色,肌纤维呈黄色。子宫骶韧带中胶原纤维含量较多,弯曲成弹簧状的弹力纤维见于动脉内皮,肌纤维含量少,与胶原纤维交错存在。③免疫组化染色结果：TH抗体特异标记交感神经结果阳性,VIP抗体特异标记副交感神经结果阳性,D2-40抗体特异标记淋巴管免疫组化染色结果阳性。证实子宫骶韧带中的神经成分包括交感神经和副交感神经,可见交感神经节。淋巴管呈散在分布,偶见淋巴结。2.宫颈周围韧带及其内神经脉管的数字化三维模型基于宫颈周围韧带内各组织的连续切片数据集,结合计算机三维重建技术,可成功构建出宫颈周围韧带内神经脉管数字化三维模型,该模型由以下子模型组成。2.1宫颈周围各韧带及其内神经脉管数字化三维模型(1)子宫主韧带及阴道旁组织数字化三维模型的长度为54.60mm,宽为70.80mmm,厚为4.20mm。模型可见丰富的各级血管；富含自主神经,包括交感神经与副交感神经,且交感神经含量明显多于副交感神经,可见交感神经与副交感神经节；淋巴管呈散在分布。(2)子宫骶韧带数字化三维模型的长度为37.10mmm,宽为25.20mm,厚为4.00mm。模型可见大量血管,以中、小动静脉为主；富含交感神经节及神经纤维,包括少量副交感神经,且神经多与血管伴行；淋巴管细小呈散在分布,偶见淋巴结。(3)血管数字化三维模型：不论是在子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型还是在子宫骶韧带数字化三维模型内,血管均主要走行于各韧带模型的上半部分。通过Mimics软件对其进行测量：在子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型中动脉主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为6.20mm,4.10mm,3.60mmm；静脉主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为3.20mm,0.42mm,5.10 mm。在子宫骶韧带数字化三维模型中动脉主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为8.02mm,5.03mm,9.50mm;静脉主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为10.06mm,6.80mm,1.60 mm。(4)神经数字化三维模型：不论是在子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型还是在子宫骶韧带数字化三维模型内,神经均主要走行于各韧带的下半部分,且交感神经明显多于副交感神经。①交感神经：主要走行于韧带的下半部分。通过Mimics软件对其进行测量：在子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型中交感神经主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为9.60mm,12.40mm,10.10mm;在子宫骶韧带数字化三维模型中交感神经主干距韧带上缘近、中、远段距离分别为3.40mm,18.90mm, 10.80mm o②副交感神经：明显少于交感神经,主要走行于韧带下半部分。通过Mimics软件对其进行测量：在子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型中副交感神经主干距韧带上缘的近、中、远段距离分别为9.90mm,11.90mm,10.30mm;在子宫骶韧带数字化三维模型中副交感神经主干距韧带上缘近、中、远段距离分别为16.90mm,18.20mm,19.10mm.(5)淋巴管数字化三维模型：观察发现子宫骶韧带数字化三维模型中淋巴管含量较子宫主韧带和阴道旁组织数字化三维模型中稍多,呈散在分布,在子宫骶韧带中从盆壁侧到宫颈侧淋巴管有增多趋势。(6)配准后的宫颈周围韧带内神经脉管数字化三维模型：在宫颈周围韧带内,血管主要走行于韧带上半部,神经主要走行于韧带下半部,淋巴管呈散在分布。在子宫主韧带及阴道旁组织数字化三维模型中,血管与神经的近、中、远段间距分别是：0.50mm,1.90mm,3.10mm。在子宫骶韧带中血管与神经的近、中、远段间距分别是：3.90mm,5.81mm,7.20mm。2.2整体宫颈周围韧带神经脉管数字化三维模型通过对三维模型进行多角度,全方位、立体旋转观察,可从任意视角显示出各韧带中神经、脉管的相互关系及走行。利用测量工具也可精确显示出神经与血管间距,从而证实血管主要走行于韧带的上半部,神经主要走行于韧带的下半部。并可以此为依据可构画出PAN在宫颈周围韧带中的立体走行。结论本研究通过结合基于整体宫颈周围韧带的大组织连续石蜡切片数据集与计算机三维重建技术,构建了完整的宫颈周围韧带及其内神经脉管的数字化三维模型。通过后期计算机软件的配准及融合技术,使模型真实还原各韧带间空间立体的相互关系,不仅可以精确地显示出其内交感神经、副交感神经、淋巴管及血管在宫颈周围韧带内的分布与走行,更能够借助软件的图像缩放以及旋转功能,观察各韧带内血管、神经之间的三维立体关系,并能提供任意方位不同视角的形态学特点,便于观察者从不同角度、不同平面、不同空间方位进行细致地观察,为SNSRH手术步骤的规范化提供依据。