前言 1型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫性损伤导致的胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病。通过基因转移技术将人胰岛素原基因导人糖尿病患者体内，以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素，从而达到永久治疗的目的。胰岛β细胞含有特定前激素转化酶（PC₂和PC₃），把人胰岛素原合成为成熟的具有生理活性的胰岛素A链和B链复合体。为使得非β细胞也获得合成成熟胰岛素的能力，我们利用非β细胞内普遍表达的furin酶，采用定点突变技术，在人胰岛素原基因B-C和C-A连接处引入新的裂解位点，使人胰岛素原成为furin酶的底物。从而使非β细胞在转染突变后的人胰岛素原基因后，能够合成成熟胰岛素并分泌到细胞外。为基因治疗1型糖尿病提供实验基础。本实验目的是掌握PCR技术与鉴定方法，构建突变的人胰岛素原基因质粒，为糖尿病基因治疗提供实验研究基础。 材料与方法 1．药品与试剂 人胰岛素原基因质粒；定点突变试剂盒；PCR回收试剂盒 2．仪器 PCR反应仪 3．方法 利用定点突变技术，在人胰岛素原基因B-C和C-A连接处引入新的裂解位点。 ①人胰岛素原基因质粒增殖。 ②设计突变所需引物。 ③代R循环。 ④琼脂糖凝胶电泳，回收③中的3112bp的目的基因片段。 ⑤对目的基因末端平滑及5‘端磷酸化处理，用连接酶连接目的基因。 ⑥连接物转化感受态大肠肝菌HB101 ⑦选阳性克隆测序。实验结果 突变的人胰岛素原cDNA测序结果证实在人胰岛素原基因B一C和C一A连接处引人新的裂解位点:位点IB一C连接处:幼5 Thr Alg Arg一ArgT七r场5 Arg位点nC一A连接处:玩u Gln场sA嗯一Arg Gln Lys Alg结论 理论上由单一蛋白质缺乏所致疾病是基因治疗的适应症。在动物研究方面，许多代谢性疾病可由基因治疗而治愈。1型糖尿病是由于胰岛p细胞自身免疫损伤而导致胰岛素分泌不足而致，既然糖尿病是单一蛋白质缺乏，理所当然是基因治疗的适应症。 在真核细胞内蛋白质合成和分泌有两种途径:1、组成型蛋白质分泌途径（CPSP）;2、调节型蛋白质分泌途径（R玲P）。胰岛p细胞含有特定前激素转化酶（PC:和PC3），合成成熟的胰岛素（A链和B链复合体）。合成过程中，胰岛素原B与A链间的C肤被裂解掉，发生在B一C连接处，裂解位置是Arg一Arg碱基;发生在C一A连接处，裂解位置是琦s一Arg碱基。 在过去的糖尿病基因治疗模型中，人胰岛素原基因转染非p细胞，其主要表达为胰岛素原和少量成熟胰岛素，且不能分泌至细胞外。在大多数非p细胞内含有特定的内源性的，依赖于高尔基器的合成酶加rin。虽然几五n酶也象PC:和PC3，在二元碱基处裂解底物，但两者底物是不同的。在非p细胞内不能合成人胰岛素。 本实验我们的目的是通过某种方法使非p细胞能够产生成熟胰岛素。为使非p细胞准确高效的合成成熟胰岛素，我们利用了非p细胞内含有允五n酶的特点。采用定点突变技术把允五n酶的裂解序列（七g一X一场s一Arg）引人到人胰岛素原cDNA中，使得人胰岛素原成为允五n酶的底物，这两个新的裂解位点发生在人胰岛素原B一C和C一A连接处。 位点IB一C连接处:场5 Thr Arg Arg一Arg Thr场5 Arg 位点nC一A连接处:玩uG玩场5 Arg一七9 Ghi Lys Arg 通过转染，人胰岛素原可被加工成成熟的，具有生理活性的胰岛素。因此我们构建了一个携有突变人胰岛素原基因的质粒，通过转染，使其在非p细胞内表达，合成成熟胰岛素，为1型糖尿病的基因治疗打下了实验基础。