原发性高血压(EH)是一种独立的疾病,同时又是导致动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病的高危因素,因此,如何有效的防治EH的发生发展对于预防心脑血管疾病至关重要。然而,到目前为止,由于EH的发病机制还不清楚,限制了临床上对EH疾病的防治。经典的钙激活氯通道(CaCC)广泛存在于心血管系统中,参与调节心肌细胞兴奋性及血管平滑肌的舒缩功能。然而由于其编码基因未知,限制了经典CaCC在心血管系统中作用的进一步研究,直到Anoctamin1(ANO1)——anoctamins家族中的一员,被证实为经典的CaCC的编码基因,才开启了经典CaCC在心血管系统中的作用研究的新篇章。最新资料表明,ANO1编码的CaCC参与了对机体动脉血压的调节;然而,ANO1是否参与了EH的发病过程呢?目前未见报道。因此,我们以自发性高血压大鼠(SHRs)为EH的动物模型,针对ANO1在EH发生发展过程中可能发挥的作用进行如下探讨:(1)鉴定ANO1在SHRs不同部位血管中的功能性表达的情况;(2)观察ANO1对SHRs血压的影响及可能的机制。研究内容及所用的实验方法:1.利用Western blotting方法观察ANO1在SHRs不同部位血管组织中的表达;急性分离血管平滑肌细胞(VSMCs),利用全细胞膜片钳技术,记录VSMCs ANO1依赖性的钙激活氯电流。2.利用Western blotting方法检测ANO1是否存在糖基化修饰。3.组织贴块法原代培养大鼠VSMCs,观察ANO1的表达及功能。4.利用血管灌流方法,针对大鼠肠系膜动脉环进行研究,利用ANO1的特异性抑制剂T16Ainh-A01探讨ANO1对血管舒缩功能的影响。5.利用siRNA-ANO1干扰技术减弱SHRs内源性ANO1的功能性表达,进一步观察ANO1对SHRs收缩压(SBP)及舒张压(DBP)的影响。6.利用MTT法,观察ANO1在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的VSMCs增殖中的作用;并利用原代培养的VSMCs,借助基因干扰技术进一步验证ANO1对VSMCs胞内钙信号的影响。实验结果:1.与wistar-kyoto(wky)大鼠相比,在shrs颈动脉、胸主动脉、肠系膜动脉及其分支、股动脉及其分支组织中,ano1的蛋白(150kd±)表达均显著增多(p<0.01);在原代培养的wky大鼠及shrs主动脉及肠系膜动脉smcs上ano1的蛋白表达水平亦表现出相似的结果;2.与来源于wky大鼠主动脉及肠系膜动脉的smcs相比,在来源于shrs胸主动脉及肠系膜动脉的smcs,可记录到更加强的钙激活氯电流,表明在血管组织中表达的ano1均为功能性cacc。利用sirna-ano1减弱原代培养的shrs肠系膜动脉的smcs,所记录到的钙激活氯电流同未干扰的smcs相比显著减弱;该结果表明,在vsmcs上所记录的钙激活氯电流是由ano1介导的。3.给予糖苷酶f处理从shrs及wky大鼠胸主动脉中提取的蛋白后,检测发现ano1的蛋白分子量由处理前150kd±下降至130kd±的水平,表明在大鼠血管组织中的ano1蛋白存在着糖基化修饰。4.分别给予1,2,5,10,20,30μmol/l的ano1特异性抑制剂t16ainh-a01预孵育shrs及wky大鼠肠系膜动脉环10min,然后给予1μmol/l的苯肾上腺素(pe)收缩血管。结果显示,10μmol/lt16ainh-a01能够显著抑制pe诱导的wky大鼠肠系膜动脉环的收缩,并且能够引起1μmol/lpe预收缩的血管舒张;而20μmol/lt16ainh-a01则能够明显抑制pe诱导的shrs肠系膜动脉环的收缩效应,表明可能是由于shrs肠系膜动脉ano1蛋白表达高于wky,故需更大浓度的抑制剂才能表现出明显的抑制效应。在原代培养的wky肠系膜动脉smcs,10μmol/lt16ainh-a01能够减弱pe诱导的胞内钙荧光信号强度,说明抑制ano1活性,可以通过降低vsmcs胞内钙来引起血管舒张。5.选取12周龄的shrs和wky大鼠,尾静脉注射ano1特异性抑制剂t16ainh-a01,检测40min内大鼠sbp及dbp的变化。结果显示,10μmol/lt16ainh-a01能显著降低wky大鼠的sbp和dbp;而20μmol/lt16ainh-a01则能够明显降低shrssbp和dbp;鼠尾静脉注射sirna-ano1-lipofectamin混合物,减弱shrs内源性ano1的功能性表达,观察注射后5d以内shrs血压的变化情况。结果显示,减弱内源性ano1的功能性表达,能够显著抑制shrs动脉血压(sbp和dbp)(p<0.01)的升高。上述结果表明减弱内源性ano1的功能性表达能够降低shrs的sbp和dbp,延缓shrs高血压的进展。由此说明,ano1可能参与了shrs高血压的病理过程。6.在原代培养的wky大鼠肠系膜动脉smcs,angⅡ能够以浓度依赖性方式和时间依赖性的方式显著促进ano1的表达(p<0.01);给予1型angⅡ受体(at1r)特异性抑制剂替米沙坦能够显著抑制angⅡ诱导的ano1的表达,而at2r的特异性抑制剂PD123319则未表现出明显的抑制效应;表明AngⅡ可能是通过AT1R介导促进VSMCs ANO1的表达。PI3K/Akt是AT1R的下游信号分子。结果显示,SHRs肠系膜动脉中Akt的磷酸化水平较WKY大鼠显著升高;在原代培养的WKY肠系膜动脉SMCs,AngⅡ能够以时间依赖性的方式提高Akt的磷酸化水平;给予PI3K的特异性抑制剂LY294002能够显著抑制AngⅡ诱导的来源于WKY大鼠的VSMCs ANO1的表达。这一结果表明AngⅡ诱导来源于WKY的大鼠VSMCs ANO1的表达可能是通过AT1R-PI3K-Akt通路来实现的。7.同WKY大鼠肠系膜动脉相比较,SHRs肠系膜动脉增殖细胞核抗原(PCNA)表达显著增多,与原代培养的肠系膜动脉SMCs结果一致;MTT的结果显示AngⅡ能够促进WKY大鼠源性VSMCs增殖;给予ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01能够显著抑制SHRs源性VSMCs及AngⅡ诱导的WKY大鼠源性VSMCs PCNA的表达;同时检测发现,利用siRNA-ANO1减弱SHRs VSMCs ANO1的表达,能够抑制AngⅡ诱导的细胞胞内钙的荧光信号强度。综上所述,ANO1在SHRs血管中高表达,可能促使了高血压的发生发展,这一作用的发挥可能通过两个方面机制来实现:一是促使VSMCs胞内钙的升高,加强SHRs血管收缩;另一方面,通过促进VSMCs增殖,促进SHRs血管重构。本课题通过对ANO1在SHRs血管中的表达及作用的研究为进一步探讨EH的发病机制及有效的防治措施提供了新的靶向及新的作用靶点。