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纤维素酶是一种由内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）组成的复合酶,三者通过协同作用完成纤维素到糖的转化过程。当前纤维素酶工业生产中,非纤维素碳源已逐渐取代传统纤维素碳源,广泛应用于诱导丝状真菌产酶。然而,关于非纤维素条件下纤维素酶诱导机制的研究报道几乎还是空白。本研究采用的匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）TP-02是一株自主筛选得到的高效纤维素降解真菌,可快速利用非纤维素碳源高产纤维素酶,具有十分可观的工业应用潜力。为此,解开匍枝根霉利用非纤维素碳源生产纤维素酶的调控密钥,从而进行生产策略改良、代谢过程控制和定向工程改造具有重要意义。本研究通过分析非纤维素底物条件下匍枝根霉胞内糖组分,发现胞内含有纤维素酶的天然诱导因子纤维二糖,并找到了其合成相关的关键蛋白纤维二糖合成酶CBS。基于对CBS结构功能的鉴定及其转录调控特性研究,成功构建匍枝根霉在非纤维素碳源条件下的纤维素酶诱导模型,进而通过菌株改造初步实现利用简易碳源快速高效生产纤维素酶。主要研究成果如下:（1）经多序列比对及结构功能分析,以纤维素合成酶核心结构CESA的编码基因为探针,利用交错式热不对称PCR（TAIL-PCR）克隆得到纤维二糖合成酶的编码基因cbs（GenBank No.KT957545）。成功实现CBS在大肠杆菌BL21中的表达及纯化,进行体外实验验证CBS的功能。通过液质联用（LC-MS）和薄层层析分析CBS体外实验的产物组成,明确CBS具有以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖基供体合成纤维二糖的能力。构建R.stoloniferΔcbs突变株,发现CBS的缺失导致纤维素酶的基因转录水平下调高达85%左右,却不改变菌体表观形态和生长曲线,确定了CBS是纤维素酶合成过程中的关键蛋白。（2）为研究纤维二糖的胞内合成途径,构建尿苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶UGP和鸟苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶GGP的缺失菌R.stoloniferΔugp和Δggp,以及双缺失株Δugp::Δggp,并利用LC-MS检测各突变株的胞内糖组分。结果显示除Δggp外,Δugp和Δugp::Δggp胞内均未检测到纤维二糖峰。RT-qPCR结果显示Δugp中cbs和纤维素酶基因的转录均下调75%左右,而Δggp中被测基因的转录水平只下调20%左右。结合突变株产纤维素酶特性研究,结果显示UDPG为TP-02胞内合成纤维二糖的主要糖基供体,而GDPG可能是UDPG的替代物,在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外,利用生物信息学方法对CBS结构功能进行分析,丙氨酸扫描结果显示D210A和D300A无纤维二糖合成能力,从而确定Asp210和Asp300是CBS的关键残基。（3）基于CBS编码基因的启动子模块分析,在cbs上游发现了转录因子XYR1和CRE的理论结合位点。为了研究CBS的转录调控特性,构建缺陷株R.stoloniferΔxyr1,并利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子gpdA构建过表达菌株OExyr1。RT-qPCR结果显示,XYR1的缺失导致cbs和各纤维素酶基因转录水平下调40%左右,而其过表达则促使cbs的转录水平提高达175%。此外,OExyr1的滤纸酶活（FPA）较原株提高96%,即XYR1对CBS和纤维素酶的表达具有激活作用。进而构建了突变株Δcbs::OExyr1及其回复株Rcbs::OExyr1,结果显示即便过表达xyr1,cbs的缺失仍可导致纤维素酶基因转录水平下调80%左右,这意味着XYR1对纤维素酶的表达调控主要来自其对CBS的作用。（4）根据碳代谢阻遏因子CRE对葡萄糖的响应特性,构建完整的CRE应答曲线。结果显示,还原糖浓度高于0.6%时,CRE对纤维素酶的合成具有负调控作用。为进一步研究CRE对cbs转录的影响,构建Δcre和Δcre::Δxyr1突变株,结果显示Δcre::Δxyr1中cbs的转录水平与Δxyr1中的基本持平,即CRE对cbs不具备直接作用。而Δcre中cbs的转录上调了47%,即CRE很可能是通过阻遏XYR1的表达来达到间接调控CBS效果。基于CRE的调控特性,在3L发酵罐中通过对TP-02进行葡萄糖补料,维持还原糖浓度在0.5%左右。结果显示,补料控糖后发酵48 h的FPA酶活为3.75 IU/mL,明显高于对照（1.96 IU/m L,30 h）,且接近Δcre菌株的酶活峰值（4.16 IU/m L,30 h）。即通过调控还原糖浓度在CRE的响应下限内,可有效摆脱碳代谢调控阻遏（CCR）对纤维素酶的阻遏作用。（5）为研究纤维二糖诱导纤维素酶途径,扩增得到纤维二糖响应因子编码基因clr1和clr2。通过Δclr1和Δclr2突变株的构建及特性分析,确定纤维二糖通过激活CLR1,促进CLR2的表达,最终开启纤维素酶基因转录。此外,Zn2+对CBS的表达具有促进作用,该作用来自Zn2+对激活因子XYR1的影响。综合以上研究,构建匍枝根霉纤维素酶诱导模型,并提出两套纤维素酶合成调控方案。其一,利用组成型启动子gpdA构建匍枝根霉过表达株,对纤维素酶基因转录调控相关蛋白进行过表达。其中,过表达株OEugp::OEcbs通过实现ugp和cbs的共同过表达,最终纤维素酶基因的转录水平提高84%。其二,构建Δcre::OExyr1菌株,优化确定最佳葡萄糖浓度为4%,并在3L发酵罐中快速实现纤维素酶的高产,发酵30 h达FPA酶活峰值6.32 IU/m L。