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第一部分实验研究野生型VHL基因提高肾细胞癌细胞株786-0对TRAIL敏感性的基础研究目的：91%的散发性肾细胞癌患者中存在肿瘤抑制基因von Hippel-Lindau(VHL)的突变或失活。VHL基因以及翻译的产物pVHL能够在转录和翻译水平调节多种与肾细胞癌发生发展相关基因的表达,但与TRAIL介导的肿瘤细胞凋亡之间的关系并不明确,本次研究的目标是在肾细胞癌786-0细胞株上明确野生型VHL基因在TRAIL介导的肿瘤细胞凋亡中的作用。方法：我们选用肾细胞癌786-0细胞株、单克隆携带野生型VHL基因全长DNA的786-0/VHL细胞以及单克隆携带VHL基因不同类型突变DNA的786-0细胞,采用不同浓度的人重组TRAIL和40ug/ml的TRAIL作用不同的时间,利用MTT和流式细胞术来检测上述细胞株对TRAIL介导肿瘤细胞凋亡的敏感性以及野生型VHL基因是否具有提高786-0细胞对TRAIL敏感性的能力。RT-PCR和Western-Blot用于分析死亡受体DR4、DR5以及凋亡抑制蛋白c-FLIP(L)在转录和翻译的表达水平。为了准确阐明c-FLIP(L)和TRAIL介导786-0/VHL细胞凋亡的相关性,我们用脂质体2000将c-FLIP(L)转染到对TRAIL敏感的786-0/VHL细胞中,观察高表达的c-FLIP(L)和TRAIL敏感性的关系。同时我们利用DR4和DR5的拮抗抗体来观察两种死亡受体和野生型VHL基因的关系。结果：MTT检测表明表达野生型VHL基因的786-0/VHL细胞对TRAIL介导的凋亡敏感,且存在剂量和时间依赖性,其余细胞株表现出对TRAIL耐受。流式细胞仪结果表明：TRAIL(40ng/ml)处理24h后786-0/VHL细胞和786-0细胞发生凋亡的比率分别为30%和9%(P<0.05),处理72h后凋亡的比率分别为50%和10%(P<0.01)。RT-PCR和Western blot检测表明,相对于对TRAIL耐受的786-0细胞,表达野生型VHL基因的786-0/VHL细胞在转录和翻译水平DR4的表达显著上调,DR5和c-FLIP(L)的表达显著下降。质粒转染后高表达c-FLIP (L)的786-0/VHL细胞从TRAIL敏感转变为TRAIL耐受(P<0.05)。为了进一步证实DR4和FR5的表达水平变化与TRAIL敏感性的相互关系,我们利用DR4和DR5拮抗抗体分别特异性地阻断DR4和DR5介导的TRAIL信号通路。结果发现：DR5被阻滞后,786-0/VHL细胞仍然对TRAIL介导的细胞凋亡敏感；而DR4被阻滞后,786-0/VHL细胞从对TRAIL介导的细胞凋亡敏感转换为耐受(P<0.05)；同时联合应用DR4和DR5的拮抗抗体,其结果与单独阻断DR4的结果相似(P<0.05)。结论：相对于TRAIL耐受的786-0细胞,表达野生型VHL基因的786-0/VHL细胞在转录和翻译水平提高了死亡受体DR4的表达和降低了凋亡抑制蛋白c—FLIP(L)的表达。应用DR4拮抗剂和高表达的c—FLIP(L)基因后的786-0/VHL细胞从TRA工L敏感转变为TRAIL耐受。上述的结果阐明了野生型VHL基因可以使TRAIL抵抗的786-0细胞敏感化,其他突变类型的VHL没有类似作用。并且VHL基因导入786-0细胞后的DR4受体表达水平上升和c—FLIP(L)表达水平下调是导致786-0/VHL细胞对TRAIL敏感的重要分子机制。第二部分综述VHL-HIF-VEGF信号通路和肾细胞癌VHL基因定位于染色体3p25-26,其产物pVHL与一些信号通路、缺氧诱导因子、氧化磷酸化的调控有关。VHL基因的失活可导致VHL-HIF-VEGF信号通路异常,这与肾细胞癌的发生、发展有着密切的关系。VHL基因的失活机制主要包括基因突变,杂合性缺失和甲基化。针对VHL-HIF-VEGF信号通路的靶向治疗现已在临床上广泛的应用。通过对VHL-HIF-VEGF信号通路的研究有助于筛选用于肾细胞癌早期诊断与预后新的分子标志物。