T-DNA(Ds)标签法克隆水稻基因的研究

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shaou0633
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应用农杆菌介导的方法获得了含Ds因子的T-DNA(以下称T-DNA(Ds))插入的3000多株水稻转化群体。用Inverse PCR方法从部分独立转化植株中,分离了590条信息唯一的含Ds因子的T-DNA插入位点处的右侧旁邻水稻染色体序列。  通过对插入在水稻基因组中的T-DNA右边界及其旁邻序列的结构分析,发现T-DNA右边界的末端剪切整合位点主要发生在25bp反向重复序列中的TGACA这5个碱基上,特别在第三位的A上,其次在反向重复序列的内侧也会出现剪切整合,因而造成反向重复序列的完全缺失。也有T-DNA带上了其区域外的载体序列整合到水稻基因组中的事件发生。T-DNA区域右侧直接相连载体序列的出现,说明整个T-DNA导入植物细胞前可能是从左侧序列开始合成然后在右边界处发生通读。在整合位点的附近常发现T-DNA右边界与植物DNA之间有碱基的同源配对和一些碱基的插入。右边界碱基序列与植物染色体序列可以在小范围内连续相互配对,也可通过两者相互扭曲形成较好的配对,然后通过部分同源配对机制整合入植物染色体。在T-DNA右边界有时会出现短片段插入,可能是为了更好地有助于T-DNA的整合。转化水稻植株中T-DNA右边界邻近片段可以来自T-DNA区域内部不同部位,即在整个T-DNA区域内几乎任意位点都能产生断裂重排,其中区域内同源片段处较易产生断裂现象。整合在水稻染色体中的T-DNA旁邻序列的结构呈现出多种复杂形式,整合过程中不同形式的重排可能是造成这种复杂性的原因,并推测了几种可能的整合模式。  基于上述的T-DNA整合特征,我们建立了严格的定位筛选条件。在该严格的定位筛选条件下,通过与已知的水稻基因组序列数据库进行一致性比较分析,确定了349个旁邻序列在水稻染色体上的分布位置,构建了一个T-DNA(Ds)因子在水稻12条染色体插入的分布框架结构,为进一步利用Ds转座标签法分离水稻基因创造了条件。初步定位结果显示T-DNA(Ds)在水稻基因组中的插入分布是不均匀的。  叶片向上向内卷曲能够增强叶片坚挺直立的特性,水稻突变体R05是一个T-DNA(Ds)插入引起的叶片向上向内卷曲的突变。我们通过T-DNA(Ds)标签法分离了与叶片卷曲突变相关的基因,其mRNA表达的增强能使水稻叶片向上向内卷曲。该基因编码的蛋白含有PAZ结构域和PIWI结构域,属于Argonaute(AGO)蛋白家族。在水稻全基因组中AGO蛋白家族至少有18个成员。基于蛋白序列的系统进化树分析,推测该水稻基因可能是拟南芥AGO7的直向同源基因(orthologous gene),并将其命名为OsAGO7。在水稻OsAGO7 mRNA表达增强的突变体R05中OsARF3-like基因家族的mRNA表达都有不同程度的下调。推测OsAGO7基因可能通过小RNA途径参与叶片的卷曲调控。  通过T-DNA(Ds)标签法,我们还分离了一个水稻蛋白酶抑制因子基因OsPl8-1,其编码序列为201bp,没有内含子,推断编码66个氨基酸的蛋白,具有一个蛋白酶抑制功能单位,属于Potato inhibitorⅠ家族。在水稻染色体上有两个完全相同的重复拷贝OsPl8-1a与OsPl8-1b,两者正向重复且相距13kb左右,位于水稻第八号染色体,相应于BAC克隆P0528B09(Accession No.AP004703)上。RT-PCR实验分析表明在水稻中花11中,OsPl8-1a和OsPl8-1b都能表达。为了深入了解OsPl8-1基因的生理学功能,我们分析了该基因的启动子驱动GUS报告基因在水稻不同发育时期的表达特性,结果表明在根组织部位没有检测到GUS信号;在顶端分生组织处检测到活跃的GUS活性;在幼苗时期相对较嫩的节和节间处没有GUS活性的存在,但是成熟节部位及附近有明显的GUS活性;虽然在顶端分生组织附近幼嫩的叶原基分生组织中没有检测到明显的GUS活性,但是OsPl8-1启动子在成熟叶片中有明显的伤害诱导反应;在花药的发育过程中,GUS信号特异地集中在花药内壁和绒毡层之间的中间层处;在种子萌发时GUS基因逐渐在与胚相邻的盾片一侧大量表达。这些组织特异性表达说明OsPl8-1基因具有多种内在的生物学功能。文中讨论了OsPl8-1基因编码的蛋白对蛋白酶的抑制作用以及两者之间的平衡关系对生物发育过程(如种子的萌发、绒毡层的降解、细胞的程序性死亡等)的潜在影响。
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